抗肿瘤药LS-177的药物动力学研究

张 健，郑 琪，魏思佳，唐 星，王艳娇

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

抗肿瘤药LS-177的药物动力学研究

张 健，郑 琪，魏思佳，唐 星，王艳娇*

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016）

目的建立一种超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），测定新药LS-177比格犬血浆质量浓度，并将此方法用于测定LS-177的口服生物利用度，为LS-177口服制剂的研究提供科学数据。方法利用双周期交叉实验方案，以比格犬为试验对象，选用液-液萃取的血浆处理方法，利用UPLC-MS/MS法对比格犬血样进行测定。结果LS-177的血浆质量浓度分别在0.1～400和2～2 000 μg·L-1内呈线性，方法精密度(RSD)和准确度(RE)分别小于10.38%和14.71%，LS-177的口服生物利用度为10.05%。结论建立的UPLC-MS/MS法可用于LS-177的药物动力学研究，LS-177口服生物利用度低。

药剂学； 药物动力学； 超高效液相-串联质谱；LS-177

研究发现HGF/c-Met信号通路在很多肿瘤组织包括肺癌组织中会出现异常的活化。而c-Met的过度扩增、表达或者突变，会导致HGF/c-Met信号通路异常活化，进而促进肿瘤的生长、侵袭和转移[1-4]。因此有效抑制异样活化的HGF/c-Met信号通路，可以改变肿瘤的状态、抑止肿瘤的增长、并使肿瘤的侵袭能力减弱。因此HGF/c-Met的靶点治疗药物纷纷被研究，包括抗体、拮抗剂、小分子抑制剂等等。LS-177是一种4-（2-氟苯氧基）喹啉衍生物，是基于foretinib 的结构基础上设计并合成的一种小分子抑制剂[5]。在对c-Met激酶及A549、H460、HT-29、MKN-45、SMMC-7721和U87MG 6个典型癌症细胞系进行体外活性筛选的研究中发现，LS-177抑制c-Met的IC50值是0.59 nmol·L-1，被认为是具有许多靶点受体的酪氨酸激酶抑制剂[6]。在对LS-177的理化性质进行研究后发现，LS-177在水及油中的溶解性均较差，限制了其液体制剂方面的发展，选择将其做成口服制剂，在进行lS-177口服制剂开发前，对于LS-177的口服生物利用度的考察至关重要，且本文是对比格犬血浆中LS-177的含量测定方法的首次报道。本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法定量检测不同给药途径后比格犬的血浆质量浓度，并测定LS-177在比格犬体内的口服生物利用度，为LS-177口服制剂的开发提供数据支持。

1 仪器与材料

YKH-Ⅱ涡旋混合器（江西医疗器械厂），液相色谱系统为ACQUITY UPLC (ACQUITY UTRA PERFORMANCE LCTM，Waters Corp，Milford，MA，USA），MS/MS系统为Waters TQ Detector（配备电喷雾离子源，美国Waters公司)， FA-1140电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），LG16-C高速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司），HC-3018R高速冷冻离心机（中科中佳仪器有限公司）。

LS-177（批号 20140910，沈阳药科大学药物化学实验室），肝素钠 （天津生物化学制药厂），氯雷他定（原料药，沈阳药科大学药物制剂实验室赠），甲醇、甲酸、乙腈（色谱纯，飞世尔科技有限公司），甲基叔丁基醚（色谱纯，天津博迪化工有限公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），空白比格犬血浆（沈阳药科大学）。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS方法的建立

2.1.1 溶液的制备

LS-177储备溶液制备：精密称取LS-177 2 mg置于200 mL量瓶中，用甲醇配制成10 mg·L-1的储备液。

LS-177标准溶液的制备：取适量上述储备液用甲醇稀释成5 000、2 500、1 000、500、250和100 μg·L-1的系列溶液，取250 μg·L-1溶液适量，用甲醇稀释成50、10、2.5 μg·L-1的系列溶液，冷藏保存备用。

内标溶液的制备：精密称取氯雷他定6.5 mg置于100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，取出1 mL置于100 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得650 μg·L-1的内标液，冷藏保存备用。

2.1.2 血浆样品的处理

2.1.2.1 静脉推注给药后比格犬血浆样品的处理

向100 μL血浆样品中加入内标溶液及甲醇各20 μL，涡旋1 min，混合均匀。加入甲基叔丁基醚3 mL，涡旋萃取10 min，5 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液2 mL置于空白5 mL EP管中，40 ℃下氮气吹干，加入甲醇400 μL涡旋10 min将吹干样品复溶，12 000 r·min-1冷冻离心10 min，吸取上清液进样。

2.1.2.2 经口给药的比格犬血浆样品的处理

向500 μL血浆样品中加入内标溶液及甲醇各20 μL，涡旋1 min，混合均匀。加入甲基叔丁基醚4 mL，涡旋萃取10 min，5 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液3 mL置于空白5 mL EP管中，40 ℃下氮气吹干，加入甲醇100 μL涡旋10 min将吹干样品复溶，12 000 r·min-1冷冻离心10 min，吸取上清液进样。

2.1.3 色谱及质谱条件

2.1.3.1 色谱条件

ACQUITYTM UPLC色谱系统（Waters Corp，Milford，MA，USA）；Phenomenex C18色谱柱（50 mm×2.1 mm.，2.6 μm）；柱温：40 ℃； 样品室温度：10 ℃；流动相：A为体积分数0.1%甲酸乙腈溶液，B为体积分数0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱条件见表1；进样量：5 μL。

Table 1 Gradient condition of UPLC表1 超高效液相洗脱方法

2.1.3.2 质谱条件

Waters ACQUITYTM TQD三重四级杆串联质谱仪（Waters Corp.， Manchester，UK）；电喷雾离子接口（ESI）；ESI源正离子电离方式；毛细管电压2.0 kV；锥孔电压和提取电压分别为35 V和30 V；源温和去溶剂化温度分别为100和400 ℃；去溶剂气（氮气）流速450 L·h-1；锥孔气（氮气）流速50 L·h-1；碰撞气（氩气）流速0.18 mL·min-1；定量模式为多重反应监测（MRM）；用于定量分析的离子反应：m/z 727.96→m/z 112.13 (LS-177)；m/z 383.18→m/z 337.13 (氯雷他定)。LS-177和内标氯雷他定［M+H］+的产物离子全扫描质谱图见图1，LS-177和内标氯雷他定的化学结构式见图2。

Fig. 1 MS-MS spectra of ［M+H］+ions of LS-177 (A) and internal standard loratadine (B)图1 LS-177及氯雷他定子离子质子扫描图

Fig. 2 Chemical structure of LS-177(1) and loratadine(2)图2 LS-177(1)及氯雷他定(2)的化学结构式

2.1.4 专属性试验

取6只试验用比格犬的混合空白血浆100 μL，不加内标溶液，后续操作按“2.1.2.1”条进行，处理后进样5 μL，色谱图见图3A；向空白血浆中加入已知浓度的LS-177标准溶液及氯雷他定溶液，后续操作按“2.1.2.1”条进行，处理后进样5 μL，色谱图见图3B。LS-177和氯雷他定的保留时间分别为1.85和2.01 min。取比格犬静注血浆样品按“2.1.2.1”条操作，色谱图见图3C。由图3A可知，定量检测LS-177和氯雷他定的2个通道中，对于放大的色谱图中主药及内标的出峰位置信噪比小于3，均未达到主药以及内标的检测限，可知比格犬空白血浆中的内源性物质不干扰LS-177和氯雷他定的测定。

Fig. 3 Representative SRM chromatograms of LS-177 (channel a) and IS loratadine (channel b) in beagle dog plasma图3 超高液相色谱法专属性实验结果

2.1.5 标准曲线的制备与定量下限的确定

2.1.5.1 静脉给药血浆测定方法LS-177标准曲线

向100 μL空白血浆中加入LS-177标准溶液20 μL，分别配制成LS-177的血浆质量浓度为2、10、50、200、500、1 000和2 000 μg·L-1的样品，不加甲醇继续按“2.1.2.1”条操作，记录色谱图。以LS-177质量浓度（ρ）为横坐标，LS-177与氯雷他定峰面积比值为纵坐标，选用加权（W=1/X2）最小二乘法进行线性回归，所得LS-177的典型回归方程如下：Y=0.486 888ρ+10.771 6，r=0.995 0，结果可知LS-177的血浆质量浓度在2～2 000 μg·L-1内线性良好。

2.1.5.2 经口给药血浆测定方法LS-177标准曲线

向500 μL空白血浆中加入LS-177标准溶液20 μL，分别配制成LS-177的血浆质量浓度为0.1、0.4、2、10、40、100、200和400 μg·L-1的样品, 不加甲醇继续按“2.1.2.2”条操作，记录色谱图。计算方法同“2.1.5.1”条， LS-177典型回归方程如下：Y=0.852 661ρ+3.712 35，r=0.996 0，结果可知LS-177的血浆质量浓度在0.1～400 μg·L-1内线性良好。

2.1.5.3 定量下限的确定

按“2.1.5.2”条操作，配制LS-177血浆质量浓度为0.1 μg·L-1的样品，在方法学考察的第1天进行6个样品分析，代入当天的标准曲线中计算每个样品的实测质量浓度，经计算RSD为9.26%。结果可知利用UPLC/MS/MS法测定血浆中的LS-177的定量下限为0.1 μg·L-1。

2.1.6 精密度与准确度试验

按“2.1.2”条2种方法分别配制成LS-177血浆质量浓度为4.0、100.0、1600.0 μg·L-1和 0.2、20.0、320 .0 μg·L-1的质控样品，各质量浓度分别进行6样品分析，连续进行3 d的测定，代入当天的回归方程，求算QC样品的实测质量浓度，计算准确度与精密度，结果见表2 。

Table 2 Accuracy and precision of UPLC-MS/MS method for determination of LS-177 in plasma samples表 2 超高效液相质谱连用法测定LS-177血浆质量浓度的精密度与准确度

2.1.7 提取回收率试验

将血浆的上清液全部取出，剩余其他均按“2.1.2”条2种方法操作，分别配制成LS-177血浆质量浓度为4.0、100.0、1600.0 μg·L-1和0.2、20.0、320 .0 μg·L-1的质控样品，各质量浓度分别进行6样品分析。

再取100 μL和500 μL空白血浆，不加甲醇及内标，将萃取上清液全部取出，并将相应质量浓度的LS-177溶液和氯雷他定溶液加至上清液中，其他按“2.1.2”条操作，进样分析。

同一质量浓度样品经上述2种方法处理后得到的峰面积做比值计算，提取回收率结果见表3。

Table 3 Recovery of LS-177 and internal standard (Loratadine) using different processing methods of plasma表3 不同血浆处理方法下LS-177及内标的回收率

2.2 双周期交叉实验设计

取健康雄性比格犬6 只，体质量为8.00～10.15 kg。给药方案如下：将试验用禁食12 h后的比格犬，随机分为A、B 2组，给予A组比格犬口服LS-177原料药胶囊（规格75 mg），B组给与静脉推注LS-177溶液剂（规格15 mg），推注时间2 min。经过1周的清洗期，进行第二周期试验，将A、B组比格犬给药方式对调即可。经口给药组于给药前（0 h）和给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、72和96 h 静脉取血2 mL，离心后取血浆1 mL， -40 ℃储存备用。静注组于推注前（0 h）和推注后3、10、15和0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h 静脉取血2 mL，离心后取血浆1 mL，-40 ℃储存备用。

2.3 LS-177体内药物动力学结果

2.3.1 血浆药物质量浓度-时间曲线的绘制

试验用比格犬在通过2种给药方式后，用已建立的UPLC-MS/MS法所测得的LS-177平均血浆质量浓度-时间曲线如图4所示。

Fig. 4 Mean [SD] plasma drug concentration after intravenous and per oral administration of LS-77图3 比格犬单次口服及静脉注射LS-177的平均血药浓度

2.3.2 口服生物利用度的计算

对LS-177的实验数据进行处理，主要的药物动力学参数、用梯形法计算两种给药方式后LS-177的AUC0-t结果见表4，并根据口服LS-177和静注LS-177的AUC0-t计算LS-177的绝对生物利用度为10.05%。

Table 4 Pharmacokinetic parameters of LS-177 for different administration routes in beagle dogs (n = 6)表4 比格犬不同给药方式下LS-177的药物动力学参数

3 讨论

a. 进行本实验前对新药LS-177进行结构分析及溶出度实验考察，发现LS-177是属于分子量大且由多个脂环构成的化合物，体外溶出度差，考虑到其在体内的吸收困难，会导致其在血浆中的质量浓度过低，因此建立了灵敏度高的超高效液相-串联质谱法，以检测比格犬体内LS-177的质量浓度。

b. 对预实验的结果进行分析，发现若采用静注血浆样品的处理方法对口服血浆样品进行处理，部分口服方式的血浆样品中的LS-177质量浓度低导致检测不到，需要萃取更多血浆中的LS-177才能准确定量，而都采用口服血浆样品处理方法时，由于LS-177存在高浓度抑制作用，使得静注给药的高浓度的LS-177血浆样品不能够准确得到定量，增加稀释溶剂虽可解决此问题但同时也会产生新的系统误差，所以本研究采用两种不同的血浆处理方法，建立两条标准曲线，精密度及准确度的结果均符合方法学的要求，可证明两种方法是经过验证的并可以分别准确的定量不同给药方式比格犬血浆中LS-177的质量浓度的。

c. 对LS-177药物动力学参数进行分析，静注和口服方式的 LS-177在比格犬体内的半衰期分别为(23.35±44.51)和(26.37±20.53) h，半衰期较长，适合将LS-177做成速释口服制剂，口服方式LS-177的AUC0-t低，证明LS-177的口服生物利用度低，提高LS-177的口服生物利用度将成为LS-177口服制剂的主要研究目标。

4 结论

本实验采用液-液萃取处理血浆样品的方法对比格犬血浆样品进行处理，并成功建立了UPLC-MS/MS法测定比格犬血浆中的LS-177的质量浓度，方法灵敏，准确度高。分析了不同给药方式的LS-177的药动学参数，可知LS-177在体内的半衰期分别为(23.35±44.51) h（静注）和(26.367±20.53) h（口服），口服LS-177的达峰时间为(5.33±4.04) h，峰质量浓度为（39.67±32.50）μg·L-1，静注的LS-177最高的血浆质量浓度为3 521.82 μg·L-1，通过梯形法计算LS-177血浆药质量浓度-时间曲线下面积，经计算静注方式和口服方式LS-177的AUC0-t分别为（1551.6±646.911）μg·h·L-1和（779.92±453.29）μg·h·L-1，口服的AUC0-t乘以剂量折算系数与静脉注射的AUC0-t做比值，经计算的LS-177的绝对生物利用度为10.05%。

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Study in pharmacokinetics of antineoplastic LS-177

ZHANG Jian, ZHENG Qi, WEI Si-jia, TANG Xing, WANG Yan-jiao*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo set up a quantitative UPLC-MS/MS method of LS-177 in beagles plasma, and to determine the oral bioavailability of LS-177 with this method and provide the scientific data to prepare oral formulation of LS-177.MethodsAccording to the two period cross-over design, beagles were provided different dose of LS-177, then liquid-liquid extraction method was chosen to process the plasma samples and LS-177 was determined by UPLC/MS/MS.ResultsThe LS-177 plasma concentrations calibration curves of UPLC/MS/MS was linear in the range of 0.1-400 and 2-2 000 µg·L-1, and the precision (RSD) and accuracy (RE) were less than 10.38% and 14.71%, respectively. The oral bioavailability of LS-177 was 10.05%.ConclusionUPLC-MS/MS method is established successfully in this study, which is used in pharmacokinetics of LS-177 in beagles. The oral bioavailability of LS-177 is low.

pharmaceutics; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS; LS-177

R94

： A

(本篇责任编辑：赵桂芝)

（2015）05-0173-08

10.14146/j.cnki.cjp.2015.05.003

2015-03-28

张健（1990-），女（汉族），辽宁沈阳人，硕士研究生, E-mail zhangjianjob1@126.com; ＊

：王艳娇（1968-），女（汉族），辽宁沈阳人，副教授，硕士，硕士生导师，主要从事药物新剂型及中药现代化研究，Tel. 024-23986343，E-mail wang53k2002@163.com。