三角帆蚌一种新型SOD基因的克隆与表达分析

杨受保　林钰如　钱瑶璇　吕思思　陆　燚　王　恒

(绍兴文理学院　生命科学学院，浙江　绍兴312000)



三角帆蚌一种新型SOD基因的克隆与表达分析

杨受保林钰如钱瑶璇吕思思陆燚王恒

(绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴312000)

摘要：采用RT-PCR和RACE技术，从三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)中克隆到了一个新型超氧化物歧化酶基因(命名为HcSODn).HcSODn基因的长度为1575 bp，包括一个长804 bp的开放阅读框，编码267个氨基酸的蛋白，并含有一个保守的Cu_Zn_SOD结构域.HcSODnmRNA在所检测的三角帆蚌的各个组织中均有表达，而腮中最高.在嗜水气单胞菌诱导下，血细胞中的HcSODnmRNA的表达水平在3 h时显著上调(P<0.05)，表明HcSODn在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥重要作用.

关键词：三角帆蚌；超氧化物歧化酶；克隆；表达；嗜水气单胞菌

0引言

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，EC1.15.1.1，SOD)是在从细菌到哺乳动物中均广泛存在的一种金属酶，能催化超氧阴离子转变为H2O2和O2的歧化反应(2O2.-+2H+→H2O2+O2)，维持机体内O2.-等活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生与消除的动态平衡[1-2]，在抗氧化、抗辐射损伤、预防衰老、肿瘤及自身免疫病等生理病理过程中具有重要作用[3-5].同时，SOD也广泛参与炎症和免疫反应等过程，SOD活性是贝类常用的免疫抗病功能指标参数之一[6-8].

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)，隶属于瓣鳃纲、蚌科、帆蚌属，是我国特有的淡水育珠蚌，由该蚌出产的珍珠占到世界珍珠总产量的80%以上.嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是三角帆蚌等淡水贝类主要病原之一[9-11].本研究从三角帆蚌中克隆到了一个SOD基因的全长cDNA序列，并对该基因的组织分布、在嗜水气单胞菌诱导刺激下的表达情况进行了分析，为深入探讨三角帆蚌等贝类SOD基因及其在免疫反应中的功能作用提供了基础资料.

1材料与方法

1.1　实验动物及处理

三角帆蚌(H.cumingii)，为平均体重近40 g的1龄小蚌，取自诸暨山下湖，实验前在经曝气的水族箱中暂养7 d，养殖用水为充分曝气并充氧的自来水，每箱放水100L(水温20±2℃).设对照组和处理组，每组3个平行.处理组中，每只蚌用注射器从闭壳肌注射100μL嗜水气单胞菌悬液(5×107cfu/mL)，对照组注射等量的0.65%NaCl[12].

1.2　总RNA提取、反转录和全长序列克隆

取外套膜、鳃、闭壳肌和性腺组织，于处理0 h、1 h、3 h、6 h和12 h后分别取6只健康、活力良好的三角帆蚌，用一次性注射器从围心腔中抽取血淋巴液，转入无菌、经DEPC处理并预冷的1.5 mL离心管中，800 g，于4°C离心8 min，弃上清，加入适量TRIzol重悬血细胞，按照TRIzol试剂盒说明书(上海生工)提供的方法抽提总RNA；参照反转录试剂盒说明书(Promega)进行反转录.以获得的cDNA为模板，利用一对SRAP(序列相关扩增多态性，Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)引物SRAPf1 (5’——TGAGTCCAAACCGGATA——3’)和 SRAPr1 (5’—— GACTGCGTACGAATTAAT ——3’)进行PCR扩增[13-14]，电泳后挑取单一亮带进行回收纯化，与pMD-19T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR鉴定为阳性克隆后送上海立菲公司测序.测序所得序列经BLAST比对后确认为三角帆蚌SOD基因的部分序列.根据已经得到的SOD基因的部分序列设计5’RACE引物SOD5R(5’——CATTATAGCAGTTGTTGGACACG——3’)和3’RACE引物SOD3F(5’——GTTTGGAGCAGACGCTGATG——3’)，利用SOD5R和SOD3F分别和试剂盒自带的UPM引物配对，用于扩增三角帆蚌SOD基因的5’和3’端序列.RACE步骤按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行.扩增得到的片段经回收纯化后克隆入T载体并送上海立菲公司测序.

1.3　序列比对与进化分析

利用NCBI数据库中的BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast)和 ClustalW2.1(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ClustalW2.1)进行序列的比对和同源性分析；利用NCBI数据库中的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)和Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan)进行开放阅读框和功能域预测；利用MEGA4.0软件中的Neighbor-joining方法构建系统进化树.

1.4　组织分布与表达

利用实时定量PCR检测各组织，以及嗜水气单胞菌诱导前后血细胞中HcSODn基因的表达情况，三角帆蚌样品处理、血细胞准备、RNA提取和反转录等操作步骤如1.1和1.2所述.反应体系为25 μL，其中含SYBRPremixExTaq(2×) 12.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL.反应参数为：95℃ 预变性3 min，45个循环(95℃，20 sec；55℃，40 sec).基因相对表达采用2-ΔΔCT法计算，β-actin基因作为内参基因(GenBank序列号：HM045420.1).所用的引物为:SODqf (5′——TCCTTTAGTTCTACCAGTG——3′)和SODqr (5′——GTGTTCCATATCACTCATC——3′)；ActRT-f (5′- GATGATATGGAGAAGATCTG-3′)和ActRT-r(5′-CATCACCAGAGTCTAAGACA-3′)[12].

2结果

2.1　三角帆蚌HcSODn基因全长cDNA序列特征与系统进化分析

如图1所示，三角帆蚌HcSODn基因的cDNA全长1575 bp(GenBank：KT724303)，含有一个长804 bp的开放阅读框(Open read frame, ORF)，以及编码267个氨基酸的假定蛋白，该蛋白的预测等电点和相对分子质量分别为5.80和28.47 kDa；起始密码子ATG的上游为125 bp非翻译区，终止密码子TGA的下游为646 bp的非编码区；并含有一个由152个氨基酸组成的Cu_Zn_SOD结构域(63～215aa).图1中的下划线为Cu_Zn_SOD结构域,方框内为3’端含有的多腺苷酸加尾信号和转录不稳定序列。

图1　三角帆蚌HcSODn基因的核苷酸和氨基酸序列

与已经报道的序列进行了同源性比对结果显示，三角帆蚌SOD蛋白(命名为HcSODn)的氨基酸序列总体上与所选取的各种动物SOD蛋白的相似性均较高(32.82%～52.67%)，其中与太平洋牡蛎的SOD蛋白相似性最高(Crassostreagigas，GenBank序列号：XP_011435046，48.69%)，而与三角帆蚌的SOD3相似性最低(H.cumingii,GenBank序列号：AEG21073，32.82%)；而Cu_Zn_SOD结构域的保守性则很高(36.67%～64.24%)，其中与太平洋牡蛎的相似性最高(64.24%)，而与三角帆蚌的SOD3同样最低，为36.67%.与牛等高等动物的SOD相似，三角帆蚌HcSODn蛋白中Cu2+的结合位点：108、110、125位点上的组氨酸(H)与其它动物均保守，而HcSODn中186位点上为赖氨酸(K)取代组氨酸(H)；Zn2+的结合位点：125、134、146位的组氨酸(H)和149位上的天冬氨酸(D)，与其它动物也均保守；Cu2+、Zn2+之间通过125位组氨酸形成“咪唑桥”的结构[15-17](见图2).

利用ClustalW 2.1和MEGA 4.0软件,构建了基于Cu_Zn_SOD结构域氨基酸序列的系统进化树.结果表明，三角帆蚌HcSODn蛋白与太平洋牡蛎(C.gigas)的SOD蛋白进化关系最近，聚为一支(见图3)，而与脊椎动物鼠等SOD蛋白序列的进化关系相距较远.

2.2　三角帆蚌HcSODn基因的组织分布

实时荧光定量PCR检测结果显示，HcSODnmRNA在三角帆蚌的5种组织(外套膜、鳃、闭壳肌、性腺和血淋巴细胞)中均有表达，但各组织间的表达量有差异，其中HcSODn在三角帆蚌的腮中表达水平最高，其次为外套膜和血淋巴细胞，而在闭壳肌和性腺中表达水平较低(图4).

图2　HcSODn基因氨基酸序列的比对分析

图3　各种SOD蛋白氨基酸序列的进化分析

2.3　细菌诱导下血细胞中HcSODn基因的表达分析

分别于嗜水气单胞菌诱导0 h、1 h、3 h、6 h和12 h后抽取血淋巴细胞并提取RNA，按前述方法反转录成cDNA.利用实时定量PCR技术检测了嗜水气单胞菌诱导对三角帆蚌血细胞中HcSODn基因表达的影响结果，如图5所示.由图5可见，随着暴露时间的延长，HcSODn基因的表达水平逐渐升高，3 h时，显著高于对照组(P<0.05)；随后，其表达水平下降，在12 h时接近于对照组水平.上述结果显示，嗜水气单胞菌诱导可引起三角帆蚌HcSODn基因mRNA水平的变化，证明HcSODn基因在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥重要作用.

3讨论

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一类十分重要的抗氧化酶.迄今为止，已从细菌、真菌以及高等动植物中均鉴定或分离得到了SOD.根据与其结合的金属辅基的不同，SOD大体上可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD等类别[18-19].SOD基因在不同物种中常以多基因家族的形式存在，如在罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)中有Cu/Zn-SOD、线粒体Mn-SOD和细胞质Mn-SOD等类型，同时不同细胞定位的SOD在结构上也有一定的差别[20-22].

序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一种新型分子标记，其原理是针对基因外显子富含GC，而启动子、内含子富含AT的特点，设计一对由核心序列和3个选择性碱基组成的引物对基因的开放阅读框(ORF)进行PCR扩增，利用该技术，以cDNA为模板，本实验室在三角帆蚌等水产动物中成功扩增出了数十个基因的ORF序列，其中包括三角帆蚌HcSODn基因ORF序列.

本研究获得的SOD基因(HcSODn)含有一个长804 bp的开放阅读框，编码267个氨基酸的假定蛋白，该蛋白包含一个保守的Cu_Zn_SOD结构域.序列同源性比对结果表明，三角帆蚌HcSODn蛋白与其它动物SOD蛋白相似性较高，其中与太平洋牡蛎SOD及其Cu_Zn_SOD结构域的同源性分别为48.69%和65.79%.此外，HcSODn蛋白中，Cu2+和Zn2+的结合位点中的组氨酸、天冬氨酸及其所在位点，与牛等其它动物SOD均很保守.以上序列同源性及其结构特征分析结果显示，与已报道的三角帆蚌SOD3相比较[15]，本研究获得的HcSODn基因是三角帆蚌铜锌SOD超家族的一个新成员.

为了进一步分析HcSODn基因的功能，本研究利用实时定量PCR技术，检测了HcSODn基因在不同组织中的分布情况，以及在嗜水气单胞菌诱导下血细胞中HcSODn基因的表达情况.结果显示，HcSODn基因在三角帆蚌的鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团和血淋巴细胞等不同组织中均有组成性表达，其中腮中最高.腮不仅是贝类等滤食性动物的摄食器官，也和外套膜、血淋巴细胞等组织一起，组成贝类防御病原等外来异物入侵的重要屏障[12,23]，腮中HcSODn基因的高水平表达，提示该基因在三角帆蚌天然免疫中发挥重要作用.嗜水气单胞菌诱导可引起三角帆蚌HcSODnmRNA表达水平的变化，在3 h后显著高于对照组.研究表明，嗜水气单胞菌感染，可引起背角无齿蚌和褶纹冠蚌血清中的SOD活性的变化[24-25]；研究表明，内脏团插核手术后三角帆蚌机体的免疫防御调节增强，SOD活性是背角无齿蚌等贝类免疫抗病功能指标参数之一[24].对SOD3的研究也发现，部分SNPs在基因型和等位基因频率方面均与三角帆蚌对嗜水气单胞菌感染的耐受/敏感显著相关[15].本研究的结果也证实，HcSODn基因在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥着十分重要的作用.

总之，本研究在三角帆蚌中首次克隆到了铜锌SOD超家族的一个新成员——HcSODn基因，该基因与太平洋牡蛎等动物的SOD基因具有较高的序列同源性和结构相似性；HcSODn基因在三角帆蚌的鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团和血淋巴细胞等组织中均有表达；嗜水气单胞菌诱导可引起三角帆蚌HcSODnmRNA表达水平的变化，表明该基因在三角帆蚌等贝类抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥着十分重要的作用.

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(责任编辑邓颖)

Cloning and Expression of a Novel SOD Gene from MusselHyriopsisCumingii

Yang ShoubaoLin YuruQian YaoxuanLv SisiLu YiWang Heng

(School of Life Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：A novel superoxide dismutase gene was cloned from musselHyriopsiscumingii(namedHcSODn) by reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The results show that the full length cDNA ofHcSODngene is of 1575 bp, containing an 804 bp open reading frame encoding a protein of 267 amino acids and covering a highly conserved Cu_Zn_SOD domain.HcSODnmRNA is ubiquitously expressed in all tissues examined, but mainly detected in the gill. The relative expression level ofHcSODngene is up-regulated significantly in hemocytes at 3 h when it is challenged by Aeromonas hydrophila (P<0.05), indicating the important roles ofHcSODnin innate immune responses of mollusks.

Key words：Hyriopsiscumingii; superoxide dismutase; cloning; expression;Aeromonashydrophila

中图分类号：Q785

文献标志码：A

文章编号：1008-293X(2015)10-0001-06

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.01

*收稿日期：2015-10-21基金项目：绍兴市公益项目(2013B70056)；“十二五”浙江省水产育种科技专项(2012C12907-9，2012C12907-5)

作者简介：杨受保(1975-)，男，安徽明光人，博士，副教授.研究方向：贝类种质资源与水产生物技术研究.