小鼠生物法与ELISA法检测麻痹性贝类毒素的比较

2015-03-07张晓辉王鼎南蒋林娟封震静

浙江农业科学 2015年11期

关键词：赤潮贝类毒素

杜伟，王扬，张晓辉，王鼎南，蒋林娟，封震静

（浙江省水产质量检测中心，浙江杭州 310023）

小鼠生物法与ELISA法检测麻痹性贝类毒素的比较

杜伟，王扬∗，张晓辉，王鼎南，蒋林娟，封震静

（浙江省水产质量检测中心，浙江杭州 310023）

麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是全世界分布最广、危害最大，也是最为大众熟知的一类赤潮藻毒素。本研究比较了小鼠生物法与酶联免疫吸附法（enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）检测水产品中PSP的效果。结果表明，样品中PSP含量在350μg·kg－1以上时，2种检测方法结果吻合度较好；样品中PSP含量在40～350μg·kg－1时小鼠生物法无法检测到样品中PSP，而ELISA法可以快速检测样品中PSP；在PSP阴性样品中两者检测结果一致。通过比较研究，2种方法在快速筛选PSP时各有优缺点，日常检测工作中将2种方法适当结合可提高检测结果准确度。

麻痹性贝类毒素；小鼠生物法；酶联免疫吸附法

赤潮（red tides）或有害藻华（harm ful algal blooms）是指在一定环境条件下，海洋生物特别是单细胞藻类迅速增殖或积聚而产生的一种海水变色的自然现象［1］。研究表明，赤潮已经对海洋环境、天然海洋生物资源、近海养殖业、近海旅游业等产生了极大消极作用，其中有毒赤潮藻的影响尤为严重。有毒赤潮藻通过食物链不仅影响海洋生态系统的结构和功能，而且威胁海洋食品安全。人类食用含有贝类毒素（赤潮藻毒素）的食品时可能中毒，有些贝类毒素甚至有致死风险。与全球赤潮发生趋势一样，我国近岸海域赤潮发生频率一直呈上升态势，且近些年东海海域有毒赤潮记录大幅上升［2－3］。海洋有毒赤潮藻及其产生的贝类毒素已经成为当今全球赤潮研究的重要内容。

麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是世界分布最广、危害最大的一类赤潮藻毒素，它是一类拥有胍基的三环氨基甲酸酯类化合物及其衍生物，由石房蛤毒素（saxitoxin，STX）及其天然衍生物如膝沟藻毒素（gonyantoxins，GTXs）、新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neoSTX）组成，由海洋有毒甲藻代谢产生。PSP是一类膜神经性毒素，可以导致中毒者神经麻痹［4］，它有2个滴定点，pKa分别是8.2和11.5，它们之间很容易相互转化，即毒性低的也可转化为毒性高的。可产生麻痹性贝类毒素的有毒赤潮藻包括塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、巴哈马麦甲藻扁平变种（Pyrodinium bahamense var．compressum）、链状裸甲藻（Gymnodinium catenatum）等。PSP的基本结构式见图1［5］。

图1 PSP的基本结构

目前，常用的PSP检测方法包括小鼠生物法、高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱⁃质谱法、毛细管电泳法、X⁃射线结晶分析法、核磁共振检测法、神经受体结合检测法、免疫学检测技术、细胞毒性检测技术等，其中免疫学检测技术在实践中常用的为酶联免疫吸附法（enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）［6］。本文比较了小鼠生物法与ELISA法检测样品中PSP含量，旨在为一线检测人员高效、快速、准确地检测水产品中PSP含量提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用缢蛏、钉螺、花蛤、扇贝购自浙江省主要贝类产区水产市场。试验用小鼠为ICR系雄性小鼠，体重18～20 g；麻痹性贝类毒素检测试剂盒购自美国ABRAXIS公司；麻痹性贝类毒素标准品（纯度99.5%）购自加拿大国家研究委员会。其他分析试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

酶标仪，精度为0.1 g的电子天平，机械秒表，均质器，冷冻低速离心机，移液枪，微量多通道加样器，1 mL注射器，200 m L量筒，电炉，烧杯等。

1.2 样品处理与制备

用清水彻底洗净贝类外壳，切断闭壳肌或小心敲破钉螺外壳，开壳，用清水淋洗内部以去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，用双蒸水洗净取出的贝肉，然后沥水5 min，捡出碎壳等杂物，将贝肉均质备用。切记不要割破肉体，尤其是肠腺部分要保持完整、不被割破。

缢蛏加标样品按以下步骤处理：分别取往年实验室检测任务中缢蛏PSP阴性样品3份，每份220 g，分别加入配制好的，含PSP量为132，88和66μg的标准溶液，制成缢蛏加标样1、缢蛏加标样2和缢蛏加标样3。

1.3 小鼠生物测定法

均质样品中麻痹性贝类毒素提取和小鼠试验参照SC／T 3023—2004［7］的7.2和7.3部分执行。

1.4 ELISA法

取10 g均质后的贝类样品或缢蛏加标样品于干净烧杯中，加0.1mol·L－1 HCl溶液10mL充分搅拌，检测pH（pH值为2.0～4.0）。需要时，可逐滴加入5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液调整pH。将混合物煮沸并搅拌5 min，冷却后将混合液3 500 r·min－1离心10 min，上清用5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液调节pH值至2.0～4.0。取上清液40μL，用样品稀释缓冲液稀释到1.0 mL，漩涡振荡1 min；再从上步稀释的样品溶液中取50μL用样品稀释缓冲液稀释到2.0 mL，待测。

ELISA检测步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5 定量计算

缢蛏、钉螺、花蛤、扇贝及缢蛏加标样品小鼠生物法检测按SC／T 3023—2004计算PSP含量，检测结果单位为鼠单位MU·kg－1；ELISA法定量计算采用商业化ELISA分析软件，检测结果单位为μg·kg－1。根据对东海区PSP检测毒力系数的经验值，按照1 MU＝0.2μg将小鼠生物法检测结果进行换算。

对于平行样，所有计算取算术平均值。

2 结果与分析

检测结果见表1。

表1 小鼠生物法与ELISA法检测结果比较

试验结果表明，小鼠生物法和ELISA法均可对样品中的PSP进行检测。试验中缢蛏样品（1～5）、缢蛏样品加标3（PSP加标量为300μg·kg－1）小鼠生物法检测结果为阴性，即没有检出样品中含有PSP。相同样品ELISA法检测结果分别为13，15，17，16，15和288μg·kg－1，根据1.4节中对样品前处理的描述，这些样品上清液的稀释倍数为2 000倍，按照ELISA检测试剂盒提供的标准品序列可以确定该稀释倍数情况下对样品中PSP的检出限为4μg·kg－1，则可以确定缢蛏样品按照ELISA法进行检测，结果为阴性，而缢蛏样品加标3的ELISA法检测结果为288μg·kg－1，加标回收率为96.0%，满足ELISA法的加标回收率范围（70%～120%）。

从检测结果中可以看出，其余样品按照2种方法检测，其结果吻合度较好，其中缢蛏样品加标1（PSP加标量为600μg·kg－1）、缢蛏样品加标2（PSP加标量为400μg·kg－1）ELISA法的加标回收率分别为89.3%和88.0%，满足ELISA法的加标回收率范围。

根据SC／T 3023—2004中关于贝类中麻痹性贝类毒素计算方式的描述，可以确定使用标准体重为20 g的小鼠进行试验，样品中PSP检出限为350μg·kg－1；本试验中ELISA法按照操作步骤进行推算，在稀释倍数为2 000倍时，样品的PSP检出限为40μg·kg－1，如果将稀释倍数降低至1 000倍，则PSP的检出限则只有20μg·kg－1，大大低于小鼠生物法的检出限，故在检测缢蛏样品加标3时本试验中2种方法的检测结果出现差异。

综上所述，样品中PSP含量在350μg·kg－1以上时，2种检测方法结果吻合度较好；样品中PSP含量在350μg·kg－1以下、40μg·kg－1以上时小鼠生物法无法检测到样品中PSP，而应用ELISA法可以快速检测样品中PSP；本试验中在PSP阴性样品中二者检测结果一致。

3 小结与讨论

通过试验可以看出，在方法检出限以上范围内，小鼠生物法与ELISA法检测结果有较好吻合度，但通常情况下ELISA法检测结果略小于小鼠生物法，这主要是因为小鼠法是检测受试样品中PSP总量，即检测受试样品中各种PSP含量的总和，而ELISA法原理是抗原抗体反应，目前研究还局限于单抗，即检测试剂盒中一般只含有比较单一的抗体。本试验中采用的ELISA试剂盒，其所含抗体主要针对PSP中的STX，对neo⁃STX也有一定抗原特异性，故对STX的反应率为100%，对neo⁃STX的交叉反应率为50%，而对其他组分的PSP交叉反应率较小。

小鼠生物法是检测PSP的传统方法，由Sommer的Mayer于1937年创建，目前被美国分析化学家协会确定为PSP标准检测程序，其优点是操作简单、能够检测受试样品中PSP总量，缺点是所需样品量大、重现性差、受客观影响（主要是小鼠对PSP的敏感度）较大、灵敏度低等，且试验中需要用到小鼠，出于对动物福利考虑，该方法在有些国家的应用受到限制。

ELISA法属于新兴的PSP检测方法，其优点是检出限低、灵敏度高、检测速度快等，缺点是需要专门仪器设备、未知受试样品PSP含量情况下很难准确确定样品稀释浓度、检测PSP成分较单一等，且目前市售商品化检测试剂盒价格相对较高，这些都影响其普遍应用。

将一种检测方法推向市场，成本会影响其推广程度。针对本文中2种检测PSP的方法，小鼠生物法检测单一样品费用大约为100元，ELISA法检测单一样品费用超过1 000元，主要是因为小鼠生物法能够根据小鼠死亡时间及体重按照检测标准提供的换算关系直接计算样品中PSP含量，而ELISA法每次检测必须做标准曲线，然后根据受检样品在试剂盒微孔上产生的吸光度间接计算样品中PSP含量。一般商品化试剂盒含有96个微孔及其检测过程必需标准品、试剂，批量检测时按照本文操作步骤至少可以检测超过30个样品，而如果每次仅检测一个样品，则每个检测试剂盒可检测样品量不会超过5个，因此用ELISA法更适合批量检测，从而降低检测费用。

日常检测中，将2种方法适当结合能够起到互补作用，能够保证检测结果的准确性。

［1］陆斗定.全球赤潮生态学与海洋学（GEOHAB）国际合作计划［J］.海洋学研究，2002，20（1）：60－64.

［2］陆斗定，Gobel J，王春生，等.浙江海区赤潮生物监测与赤潮实时预测［J］.海洋学研究，2000，18（2）：33－42.

［3］舟山市海洋与渔业局.2004年舟山海洋环境公报［EB／OL］.舟山：舟山市海洋与渔业局，2005.http：／／www. zsoaf.gov.cn／files／news05032101.doc.

［4］ Baden D G，Fleming L E，Bean J A.Marine toxins［J］. Handbook of Clinical Neurology，1995，21（65）：75－141.

［5］ Viviani R.Eutrophication，marine biotoxins，human health［J］.Science of the Total Environment，1992（S）：631－662.

［6］杜伟，陆斗定.有毒赤潮藻及其毒素的危害与检测［J］.海洋学研究，2008，26（2）：89－97.

［7］ ST／C 3023—2004麻痹性贝类毒素的测定生物法［S］.

（责任编辑：万晶）

S 917.4

0528⁃9017（2015）11⁃1726⁃03

文献著录格式：杜伟，王扬，张晓辉，等.小鼠生物法与ELISA法检测麻痹性贝类毒素的比较［J］.浙江农业科学，2015，56（11）：1726－1728.