Ki67和nm23蛋白在鼻咽癌中的表达及临床意义

张继屏 范静平 邓月 刘越徉 何金



·临床研究·

Ki67和nm23蛋白在鼻咽癌中的表达及临床意义

张继屏 范静平 邓月 刘越徉 何金＊

目的 通过观察Ki67、nm23蛋白在鼻咽慢性炎症、鼻咽癌组织中的表达，探讨Ki67、nm23与鼻咽癌临床病理特征的相关性。方法 采用免疫组织化学方法(SP法)检测23例鼻咽慢性炎症组织和59例鼻咽癌病理组织中Ki67、nm23的表达情况，再对Ki67、nm23的不同程度表达与鼻咽癌患者的临床分期、淋巴结转移、远处转移及5年生存率之间的关系进行统计学分析。结果 ①与鼻咽黏膜慢性炎症组相比，鼻咽癌患者中Ki67的阳性表达率较高，nm23阳性表达率较低，差异有统计学意义(P<0.01)。②鼻咽癌患者中Ki67阳性表达与临床分期及远处转移之间呈正相关；生存期>5年的患者Ki67阳性率低于生存期<5年的患者。③鼻咽癌患者nm23基因的阳性表达与临床分期、颈淋巴结转移及远处转移之间呈负相关；生存期>5年的患者nm23阳性率高于生存期<5年的患者。④ Ki67与nm23两者的表达有相关性。通过生存曲线分析发现，Ki67蛋白低表达同时nm23蛋白高表达患者比Ki67蛋白高表达同时nm23蛋白低表达患者的生存时间更长。结论 鼻咽癌中Ki67、nm23的表达与肿瘤的浸润、转移密切相关，两者有望成为评估预后的相关指标。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：20-24)

鼻咽癌；Ki67；nm23；颈淋巴结转移；远处转移；生存曲线

鼻咽癌又称“广东癌”，在我国南方部分省份是常见的恶性肿瘤之一，发病率在10/100 000以上，其病因尚不明确，目前多认为与遗传、环境及病毒因素有关[1]。由于鼻咽部解剖位置隐蔽，早期症状不典型，大多数在确诊时已处于中晚期，有颈淋巴结转移，治疗效果不佳。随着近年来放疗技术的发展，3年生存率已超过90%，5年生存率约为78%，最终绝大多数患者死亡原因是肿瘤局部复发和远处转移[2]。Ki67蛋白是反映细胞增殖状态的一种核内大分子蛋白质，只在增殖细胞中表达；nm23被认为是一种肿瘤转移抑制基因，很多学者认为两者的表达异常与肿瘤的侵袭、转移相关。两者在鼻咽癌中的表达及与鼻咽癌临床分期、淋巴结转移及远处转移等关系尚有不同的结论。因此我们应用免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织中Ki67及nm23的表达，探讨其与肿瘤发生、发展的潜在关系，进一步分析两者能否成为评价鼻咽癌侵袭、浸润、转移的潜能及预后的有效参考指标。

1 资料与方法

1.1 资料 回顾2000年1月～2008年1月在本科初次就诊的鼻咽癌患者，就诊前均未接受放疗、化疗及免疫治疗等抗癌治疗；保留原始病理组织蜡块；有完整随访记录。收集符合标准的病例59例，病理分型为鼻咽非角化性癌，其中男性43例、女性16例；年龄15～80岁，平均48.4岁。所有患者均行鼻内镜检查、鼻咽部CT扫描、颈部及腹部B超、胸部正位X线片、骨单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography, SPECT)扫描，其中有3例行全身PET-CT显像。鼻咽癌分期采用1992年福州TNM分期法，其中Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期35例；有颈部淋巴结转移44例，其中N1 22例、N2 17例、N3 5例，无颈部淋巴结转移15例。Ⅰ、Ⅱ期行放疗，放疗量：NPDT 6 800～7 200 CGy；Ⅲ、Ⅳ期除放疗外，行顺铂(DDP)及氟尿嘧啶(5-FU)联合化疗方案综合治疗。随访5～84个月，中位随访时间68个月。对照组鼻咽黏膜组织标本来自23例病理报告确诊为鼻咽黏膜慢性炎症的患者，男性15例、女性8例；年龄23～68岁，平均40.5岁。

1.2 实验方法 对所有标本常规石蜡切片，苏木精-伊红 (hematoxylin-eosin, HE) 染色，核实病理组织学诊断。运用二步法免疫组织化学法检测切片组织中Ki67、nm23的表达。鼠抗人Ki67单克隆抗体及nm23单克隆抗体，免疫组织化学SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。石蜡切片采用微波修复抗原。免疫组织化学染色流程严格按试剂盒中的说明进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，用已知鼻咽癌阳性组织切片作为阳性对照。

1.3 结果判定 采用双盲法，由2名高年资病理医师分别阅片。在高倍显微镜下随机选取5个不同视野，每个视野计数200个肿瘤细胞。Ki67阳性表达细胞核(图1、2)，nm23阳性表达定位定位于胞质内(图3、4)，于高倍显微镜下呈淡黄色至棕黄色颗粒状。计算阳性细胞的百分比(阳性细胞数/总细胞计数 ×100%)。判断为“-”的标准为阳性细胞<5%，“±”为阳性细胞5%～25%， “+” 为阳性细胞25%～50%， “++” 为阳性细胞50%～75%，“+++”为阳性细胞>75%。≤25%为阴性，>25%为阳性。

图1. Ki67的阳性表达(×200)

图2. Ki67的阳性表达(×400)

图3. nm23的阳性表达(×200)

图4. nm23的阳性表达(×400)

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计学软件对数据进行统计分析，行χ2检验及Pearson列联系数分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽慢性炎症和鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达情况 鼻咽慢性炎症和鼻咽癌组织中Ki67阳性表达率分别为4.35%(1/23)和71.19%(42/59)，鼻咽癌组织中Ki67的表达率明显高于鼻咽慢性炎症组织，差异有统计学意义(χ2=27.023 2，P<0.01)。2组中nm23阳性表达率分别为91.30%(21/23)和49.15%(29/59)，鼻咽癌组织中nm23的表达率明显低于鼻咽慢性炎组织，差异有统计学意义(χ2=8.325 5，P<0.01)。

2.2 鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达情况与临床特征的关系 鼻咽癌组织中Ki67的表达随临床分期增高而增高，呈正相关，Ⅲ+Ⅳ期Ki67阳性表达高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，但Ki67的表达与性别、年龄、淋巴转移、T分期无相关性。鼻咽癌组织中nm23的表达随临床分期及淋巴结转移分期增高而降低，呈负相关，Ⅲ+Ⅳ期nm23阳性表达低于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，N2+N3分期nm23阳性表达低于N0+N1分期，差异有统计学意义(P<0.01)，但nm23的表达与性别、年龄、T分期无相关性。以上详见表1。

2.3 鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达情况与预后的关系 有远处转移组的Ki67阳性表达高于无远处转移组的，有远处转移组的nm23阳性表达低于无远处转移组的(P<0.05)。Ki67表达阳性患者的5年生存率明显低于Ki67表达阴性者，nm23表达阳性患者的5年生存率明显高于nm23表达阴性者，差异有明显统计学意义(P<0.05)。以上详见表1。

2.4 鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达互相之间的关系 鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达之间有关联，呈负相关，P<0.05，Pearson列联系数r=0.263 2(表2)。

表1 鼻咽癌组织中Ki67、nm23的表达检测

注：表中标记a为P<0.05,b为P<0.01

表2 鼻咽癌组织中Ki67与nm23表达之间的关系

2.5 鼻咽癌组织中Ki67、nm23蛋白表达与鼻咽癌患者生存时间的分析 采用乘积极限法(Kaplan-Meier)对59例鼻咽癌患者的生存时间进行单因素的生存分析，并制作生存曲线。Ki67蛋白表达(+)组的中位生存时间为(58.00±10.18)个月，Ki67蛋白表达(-)组的中位生存时间为(71.00±6.86)个月；2组间的差异具有统计学意义(P<0.05)(图5)。nm23蛋白表达(+)组的中位生存时间为83个月，nm23蛋白表达(-)组的中位生存时间为(52.00±10.25)个月；2组间的差异具有统计学意义(P<0.05)(图6)。

同时，根据Ki67、nm23相互之间的表达呈负相关性，将两者结合后进行多态生存分析。可以得到Ki67蛋白表达(-)同时nm23蛋白表达为(+)组的中位生存时间为(70.00±5.51)个月，Ki67蛋白表达(+)同时nm23蛋白表达为(-)组的中位生存时间为(43.00±7.62)个月；2组间的差异具有统计学意义(P<0.05)(图7)。

图5. Ki67蛋白表达(+)组和(-)组的生存曲线

图6. nm23蛋白表达(+)组和(-)组的生存曲线

图7. Ki67与nm23蛋白不同表达的鼻咽癌患者生存曲线

3 讨论

随着分子生物学和蛋白质组学的进展，肿瘤免疫标记物除了帮助病理确定肿瘤的类型，有些还有助于评估肿瘤细胞增殖活性和生物学行为。

Ki67基因定位于第10号染色体的长臂(10q25)上，有2个mRNA同工型，现认为Ki67的功能与细胞有丝分裂密切相关，可能参与构建DNA[3]，其确切的生理功能不十分清楚。Schluter等[4]发现其氨基酸序列包含富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的40个弱PGST区和10个强PGST区，PGST区对蛋白酶高度敏感，是易于降解的部位,因此Ki67的半衰期较短，为1 h或更短。Ki67在G1中期到后期开始出现，S期和G2期逐渐增加，M期达到高峰，随后迅速降解,G0期消失，因此其阳性表达仅限于增殖细胞，在细胞的静止期不表达，能有效地检测细胞的增殖活性与水平[5]。国内外许多研究[6-7]表明，Ki67抗原的过量表达与多种恶性肿瘤的恶性生物学行为密切相关，对肿瘤的转移及预后有影响。Gabusi等[8]报道，鼻咽癌中Ki67 高表达占35%。本研究中Ki67高表达占71.19%，存在差异的原因可能与此次入组患者的临床分期、淋巴结转移等组成不同有关。结果表明，Ki67在鼻咽癌组织的表达阳性率明显高于鼻咽慢性炎症组织，说明Ki67表达反映了鼻咽上皮的恶性转化和增殖活跃性，可作为区分良恶性的参考指标。在分析了Ki67在鼻咽癌不同T分期和颈部淋巴结转移组中的表达情况后发现，Ki67表达不同并无统计学意义，提示细胞增殖是鼻咽癌的固有特性，与鼻咽癌原发灶瘤体的侵袭范围大小及发生淋巴道转移过程中并不一定相关。进一步分析发现，Ki67 表达与患者的不同临床分期相关(P<0.05)。Zheng等[9]的研究亦得出类似结果，Ⅲ 、Ⅳ 期鼻咽癌组织中Ki67的表达明显高于I、Ⅱ期的癌组织(P<0.05)。但有不少学者[10]对此有异议，认为Ki67的表达与头颈肿瘤的分期并无必然相关性。本试验结果还显示，Ki67高表达与鼻咽癌的远处转移呈正相关，与5年生存率呈负相关，表明 ki67蛋白高表达预示肿瘤侵袭性强，发生远处转移可能性大，其5年生存率相对低。

nm23基因被认为是与肿瘤转移能力相关的抑制基因，人类nm23基因中存在2个亚型：nm23-H1和nm23-H2，位于17号染色体长臂 (17q21)上。 nm23-H1的编码产物是二磷酸核苷激酶(NDPK)，这种酶主要通过影响微管装配，调节由G 蛋白介导的细胞信号传导反应,维持细胞的正常分裂状态，从而抑制癌细胞的转移[11]。nm23基因发生突变或缺失时，nm23蛋白及编码产物减少，随之丧失对肿瘤转移的抑制功能。刘红等[12]的研究显示，乳腺癌中nm23基因表达与腋淋巴结转移及远处转移呈显著负相关；Krause等[13]研究表明，膀胱癌中nm23的阳性表达与肿瘤的分化程度呈正相关, 与分期和淋巴结转移呈负相关。本实验结果显示，鼻咽癌组中nm23阳性表达率为49.15%，与郑天荣等[14]报道的近似。在鼻咽慢性炎症组中，nm23表达阳性率显著高于鼻咽癌组，表明nm23在良恶性病变表达差异有统计学意义，表达低的组织恶变可能性大。在鼻咽癌组织中nm23阳性表达率与临床分期及颈淋巴结转移呈负相关，Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌组织中nm23的表达明显低于I、Ⅱ期的癌组织，淋巴结转移分期高的癌组织中nm23阳性表达率也明显低于淋巴结转移分期低的，差异有统计学意义，与潘艳东等[15]的研究结果一致。同时发现无远处转移组的nm23阳性表达率也高于有远处转移组，差异有统计学意义，提示nm23基因在抑制鼻咽癌的颈部淋巴结转移和远处转移中发挥一定作用，nm23的低表达则提示出现颈部淋巴结转移和远处转移的风险加大。nm23表达还与5年生存率相关，nm23高表达提示鼻咽癌预后较好，生存期长，低表达则预示预后较差。

在本次试验中，鼻咽癌组织中Ki67、nm23表达之间有关联性，呈负相关。通过生存曲线分析可发现，Ki67蛋白低表达同时nm23蛋白高表达的患者生存时间显著高于Ki67蛋白高表达同时nm23蛋白低表达的患者，进一步证明两者之间的相关性。但由于Ki67具体作用机制尚不清楚，暂时无法从信号转导通路解释，可能仅仅因为恶性肿瘤一方面表现出高增殖，另一方面易出现转移现象，从而导致两者表达出现关联性。由于肿瘤的侵袭与转移是涉及多基因、多步骤的复杂过程，加之试验样本选择、评分标准的诸多因素影响，两者的关联性有待进一步研究。

本实验证实，鼻咽癌的生物学行为与Ki67、nm23的异常表达密切相关。Ki67的高表达以及nm23的低表达反映了肿瘤组织的生物学行为较为凶险，恶性程度高，患者的预后相对较差，因此推测Ki67、nm23可作为判定参考鼻咽癌的恶性程度和预后的有价值指标。

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(本文编辑 杨美琴)

Expression and clinical significance of Ki67 and nm23 in nasopharyngeal carcinoma

ZHANGJi-ping,FANJing-ping,DENGYue,LIUYue-yang,HEJin＊.

DepartmentofOtolaryngology,ChangzhengHospitaloftheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China

FAN Jing-ping, Email:fanjingp@163.com

Objective To investigate the expression and distribution of Ki67 and nm23 in chronic nasopharyngitis and nasopharyngeal carcinoma(NPC). Then to explore the relationship between the expressions and their clinical significance of Ki67,nm23 in NPC. Methods The expression of Ki67 and nm23 were examined by immunohistochemical assay(SP method)in 23 cases of nasopharyngitis and 59 cases of NPC. A statistical analysis was done between the expression of them and the common clinical gastric parameters,such as clinical stage,cervical lymph node metastasis status, distant metastasis and 5 years survival rate. Results ①The positive expression rates of Ki67 in NPC was significantly higher than in chronic nasopharyngitis,the positive expression rate of nm23 in NPC was significantly lower than in chronic nasopharyngitis (P<0.01). ②The positive expression of Ki67 in NPC was positive related with clinical stage, distant metastasis and 5 years survival rate. The 5 years survival rate in Ki67 positive cases were lower than that of the negative cases. ③Positive expression of nm23 in NPC was negative related with clinical stage, cervical lymph node metastasis status, distant metastasis,but not with age and T stage. The 5 years survival rate in nm23 positive cases was higher than those of the negative cases. ④The expression of Ki67 and nm23 in NPC had a correlation. Through the analysis of the survival curve, the patients with low expression of Ki67 and high expression of nm23 show longer survival time than those with high of Ki67 and low expression of nm23. Conclusions The expression of Ki67,nm23 were closely related to progression,invasiveness and metastasis in NPC. The expression of Ki67,nm23 are helpful markers to estimate the biology action and prognosis of NPC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:20-24)

Nasopharyngeal carcinoma； Ki67； nm23； Cervical lymph node metastasis； Distant metastasis； Survival curve

第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科＊病理科 上海 200003

范静平(Email:fanjingp@163.com)

原单位：武警江苏省总队医院耳鼻咽喉科 扬州 225003

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.01.007

2013-11-11)