卵巢切除联合激素注射对绵羊股骨近端骨密度及生物力学性能的影响

刘 达，康 夏，谢庆云，廖冬发，黄 晨，唐影超，权 毅，张 波

（成都军区总医院骨科，四川成都610083）

研究表明，中国50岁以上的人群中骨质疏松性骨折占所有骨折的70.00%～80.00%，其中髋部是骨质疏松性骨折最常见的发病部位之一，中国每年新增的髋部骨折患者约23万。治疗骨质疏松导致的髋部骨折主要包括药物治疗及内固定等手术治疗［1-2］。而这两方面的研究都必须建立在良好的髋部骨质疏松动物模型的基础上来进行，需通过动物实验来评价药物对髋部骨密度（bone density，BD）及力学强度的作用和内固定稳定性，而良好的髋部骨质疏松动物模型是该领域研究的必要前提条件。有研究表明，绵羊髋部的解剖结构和生物力学特点与人体近似，且卵巢切除术（ovariectomy，OVX）后的绵羊体内骨质条件的变化与妇女绝经后的变化近似，可以模拟绝经后妇女的骨质疏松症［3-5］。因此，很多的研究将绵羊作为建立骨质疏松大动物模型的首选。通过文献回顾发现，越来越多的学者通过OVX 联合激素的方法来建立绵羊骨质疏松模型，主要评价了绵羊腰椎的BD 及生物力学的变化［6-11］，对于绵羊股骨近端BD 及生物力学变化的研究甚少。本实验采用去势手术联合激素应用的方法建立髋部骨质疏松动物模型，通过双能X线吸收法测量股骨近端BD，通过生物力学测试评价股骨近端的力学强度，综合评价上述建模方法对上述指标的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雌性绵羊共16只，均已过生育哺乳期，年龄为（4.56±0.52）岁，体质量为（55.02±6.47）kg，均由成都军区总医院实验动物中心提供。所有涉及动物实验的操作均严格遵守动物实验的医学伦理学规定。

1.1.2 实验耗材和药品 手术所需器械、耗材及场地均由成都军区总医院实验中心提供。双能X 线骨密度仪（Lunar Corp，Madison，WI，USA）由成都军区总医院们门诊部提供。普通空心螺钉（长度为40.00mm，直径为6.00mm）16枚，长度和直径只用于绵羊股骨颈固定，均由医用钛合金制成，由山东威高骨科器械有限公司生产。MTS 858 （MTS System，Minneapolis，MN，USA）力学实验机由西南交通大学力学实验中心提供。麻醉药品速眠新Ⅱ（每支2.0mL）为解放军兽医大学军事兽医研究所生产，每毫升含氟哌啶醇2.5mg，双氢埃托啡4.0μg，保定宁60.0mg。抗菌药物：注射用头孢唑林钠（每支1.0g，上海先锋药业有限公司）。激素：注射用甲泼尼松龙琥珀酸钠（每支0.5g，美国辉瑞制药有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、手术及BD 的测量 将16只绵羊分为假手术组和实验组，每组8只。肌内注射速眠新Ⅱ（0.10 mL／kg）麻醉成功后，将绵羊侧卧于双能X 线BD 仪的扫描台上，采用手动分析模式测定股骨近端感兴趣区域（region of interest，ROI）的BD（图1），从股骨头下、沿股骨颈方向取矩形的ROI，其宽度接近股骨颈的宽度，长度为从股骨头下到股骨外侧皮质。测量BD 之后将绵羊仰卧于手术台上，术区常规消毒铺单后，切开皮肤及皮下组织，假手术组经腹腔盆腔显露至双侧卵巢，无任何处理，反复冲洗后逐层分缝合切口。实验组实行双侧OVX，仔细缝合结扎后反复冲洗，逐层缝合。术后1个月开始肌内注射甲泼尼松龙（0.45 mg·kg-1·d-1），每月的同一天测量绵羊体质量，根据体质量调整甲泼尼松龙的注射剂量。连续注射10个月，最后1个月内逐渐减量至停止注射。停药后观察1个月，再次测量双侧股骨近端的BD。注射激素期间，对所有绵羊常规饲养。观察所有绵羊的切口愈合、注射部位感染情况及注射期间和停药后的不良反应。

图1 股骨近端ROI的BD 测量

图2 股骨近端骨组织的钻取

1.2.2 股骨近端标本的制备 去势手术后1年，处死两组中所有绵羊。取出双侧股骨，每只绵羊随机选取一侧股骨，紧贴股骨头下缘垂直于股骨颈锯断，用内径1.50cm 的自制环钻于断面中央、沿股骨颈的轴向钻取标本直至钻透股骨近端外侧皮质（图2），整个过程中采用生理盐水湿润标本。最终制成上下截面平行、高度为3.00cm、直径为1.50cm 的圆柱状股骨近端松质骨标本。另一侧股骨标本，于大粗隆尖部下方3.00～3.50cm 处顺股骨颈方向拧入螺钉。X 线检查确定空心钉位置。生理盐水纱布包裹所有标本，密封并存储于-20 ℃的条件下。实验前所有标本均在室温下自然解冻。

1.2.3 压缩实验 将松质骨标本置于特制夹具上，以5mm／min的加载速度逐渐施加轴向压力［10］，直到标本破坏即为实验终止。实验机的载荷信号由计算机数据采集系统记录并自动生成载荷-位移曲线，曲线达到最高点随即明显下降即为标本出现破坏，由相应的测试软件计算出最大压缩应力（σult）和能量吸收值（E1）。

1.2.4 轴向拔出实验 用特制夹具将标本固定于MTS 858上，沿螺钉的长轴方向以5 mm／min的加载速度进行拔出实验［10］，螺钉被拔出后停止。实验机的载荷信号由计算机数据采集系统记录并自动生成载荷-位移曲线，曲线达到最高点随机明显下降即为螺钉被拔出松动，由相应的测试软件计算出螺钉的最大轴向拔出力（Fmax）和能量吸收值（E2）。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS16.0 进行统计学分析。计量资料均采用±s表示，同组中处理前、后BD 间的比较采用配对t检验；处理前、后两组中BD 间的比较及处理后两组中生物力学参数之间的比较，均采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组绵羊大体观察 术后16只绵羊活动、进食情况及大小便正常，未发生任何手术并发症。术后切口10d后均甲级愈合。注射部位的皮肤均无感染迹象，注射期间和停药后两组绵羊均未见明显异常反应。

2.2 两组绵羊处理前、后股骨近端BD 比较 处理前两组绵羊股骨近端的BD 比较，差异无统计学意义（P＝0.752）。假手术组绵羊处理前、后的BD 无明显变化（P＝0.387），而实验组处理后的BD 显著低于处理前（P＝0.000），平均下降29.46%。处理后实验组的BD 低于假手术组，两组比较差异有统计学意义（P＝0.018），见表1。

表1 两组绵羊处理前、后股骨近端BD 比较（±s，g／cm2）

表1 两组绵羊处理前、后股骨近端BD 比较（±s，g／cm2）

a：P＜0.05，与实验组比较；b：P＜0.05，与同组处理前比较。

组别 n 处理前 处理后假手术组 8 1.05±0.10 1.07±0.11 a b 实验组 8 1.12±0.13 0.79±0.15

2.3 两组绵羊股骨近端σult及E1比较 与假手术组比较，实验组中的σult和E1分别下降38.88%和41.34%，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组绵羊股骨近端σult及E1比较（±s）

表2 两组绵羊股骨近端σult及E1比较（±s）

a：P＜0.05，与实验组比较。

组别 n σult（MPa） E1（J）假手术组 8 955.90±268.50a 2.08±0.45 a实验组8 584.20±193.62 1.22±0.38

表3 两组绵羊股骨近端Fmax及E2比较（±s）

表3 两组绵羊股骨近端Fmax及E2比较（±s）

a：P＜0.05，与实验组比较。

组别 n Fmax（N） E2（J）假手术组 8 937.80±272.52a 2.25±0.60 a实验组8 564.60±178.83 1.30±0.28

2.4 两组绵羊股骨近端Fmax及E2比较 与假手术组比较，实验组中的Fmax和E2分别下降39.79%和42.22%，均差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

3 讨 论

随着人口老龄化的日益加重，骨质疏松性骨折（脆性骨折）逐渐成为临床上的常见病。屈波等［12］通过成都市流行病学调查发现，在纳入的2 457例骨质疏松性骨折老年患者中髋部骨折的比例最高为37%。郝永强等［13］对上海地区5 923例骨质疏松性骨折的发病特点研究分析显示，髋部骨折为22%，脊柱骨折为8%。研究表明，中国骨质疏松性髋部骨折发生率为16%～20%，年发病率为180万至200万例。预计2020年和2050年髋部骨折人数为163.8万和590.8万。在2006年用于髋部骨折治疗的费用已经超过63.5亿元，预计至2020年预计会增至850亿元以上，到2050年则将达18 000亿元。骨质疏松性骨折的危害很大，导致病残率和死亡率的增加。髋部骨折后1年内死于各种并发症者高达20%，而存活者中约50%致残，生活不能自理，生活质量明显下降。而且，骨质疏松性骨折的治疗和护理需要投入巨大的人力、物力和财力，造成沉重的家庭、社会和经济负担。

目前，很多学者采用小鼠和大鼠等啮齿类动物作为骨质疏松动物模型建模的对象，主要用于抗骨质疏松药物的治疗，但该类动物体型较小，不适合进行髋部骨折内固定的模拟及力学性能的相关研究［14］。而灵长类动物无论从生理周期、行走方式，还是骨骼结构上均是与人类最为接近的动物，是骨质疏松动物模型的最佳选择。但是，饲养管理要求高，实验费用昂贵及医学伦理道德的原因让该动物的获取和应用均受到极大的制约。近年来，越来越多的学者青睐使用绵羊建立骨质疏松动物模型。绵羊价格较便宜，获取方便；性情温顺，易于管理和饲养；且激素分泌与女性类似，OVX 后的绵羊体内骨质条件的变化与妇女绝经后的变化近似，最为重要的是成年绵羊髋部的解剖结构及力学分布与人类接近［3-5］。因此，适合采用绵羊进行髋部骨质疏松动物模型的建立及内固定稳定性的相关研究。

文献回顾发现，众多学者基于绵羊进行了相关骨质疏松模型建立的实验研究。有研究发现，OVX 联合糖皮质激素注射半年和一年后，胫骨近端松质骨的BD、骨小梁体积、弹性模量分别降低了27%和33%、34%和37%、36%和62%［6］。然而，单纯行OVX 处理6个月和12个月后上述指标均无明显降低。研究认为，OVX 联合激素使用可降低骨小梁的数量和质量，是建立绵羊骨质疏松模型的可行方法。单独使用OVX 方法并不能显著降低绵羊体内某些部位的骨质条件。Schorlemmer等［7］发现，OVX 联合持续注射甲泼尼松龙（0.45mg·kg-1·d-1）6个月可以显著减少胫骨干皮质骨和胫骨近端松质骨的生成；使用上述方法12个月后可使胫骨近端松质骨的BD 和压缩刚度分别降低34%和55%。Lill等［8］研究发现，OVX 联合甲泼尼松龙注射持续6个月后，腰椎和股骨头松质骨的骨小梁数量和骨小梁厚度明显减少，骨小梁间隙明显增宽，生物力学强度也明显下降，表明OVX 联合激素可以有效地建立骨质疏松动物模型。有研究通过OVX 联合低钙饮食和激素注射的方法建立骨质疏松绵羊模型，选取BD 下降25%作为评价模型是否成功的标准，经过综合处理半年后绵羊腰椎和股骨近端的BD 分别较处理前下降29.5%和29.1%，均超过了25%的评价标准，骨质疏松模型成功建立［9］。而低钙饮食的依从性和可行性不如激素注射，并且目前中国还无统一、公认的低钙饲料，因此本实验采用了OVX 联合激素注射的建模方法。有研究发现，经OVX 的绵羊注射甲泼尼松龙3个月停药后，6～11周内会出现桡骨远端松质骨BD 的反弹（每周上升0.22%），但它 显 著 低 于 用 药 期 间BD 的 下 降 幅 度［10］。Zarrinkalam 等［11］采用OVX 联合激素注射及低钙饮食的方法建立绵羊骨质疏松模型后发现，停止使用激素后绵羊腰椎仍然保持骨质疏松骨组织的微观结构特点，并为观察骨质疏松的系统或局部治疗效果及内固定的相关研究提供了充足的观察窗口。因此，本实验中，停药后1个月的观察期并不会严重影响骨质疏松模型的建立。

目前的研究主要针对脊柱、桡骨远端及胫骨近端等部位的骨质条件及生物力学的评价，对髋部周围、尤其是股骨近端的研究甚少。本课题组在前期针对股骨近端的BD 和微观结构的变化进行了研究，而缺乏对股骨近端的生物力学强度的变化进行评价。本研究通过OVX 联合激素的方法建立髋部骨质疏松动物模型，考虑到股骨近端的脆性骨折及内固定松动的风险，采用了DEXA 测量股骨近端的BD 变化，通过压缩实验评价股骨近端的生物力学强度，顺股骨颈置入螺钉后通过螺钉的轴向拔出实验来评价股骨近端骨质对内固定的把持力。研究发现通过去势手术联合激素注射综合处理12个月后，绵羊股骨近端的BD 较前有显著的下降（P＜0.05），且平均下降大于25%（29.46%）。该方法处理后绵羊股骨近端的自身机械强度显著下降，局部骨质对螺钉的把持力也显著下降，证实了BD下降可导致骨质生物力学强度的下降，符合骨质疏松病理改变的特点。

综上所述，本研究认为去势手术联合激素注射可显著降低绵羊股骨近端的BD、骨质强度及螺钉在股骨近端的稳定性。总之，去势手术联合激素注射的方法可用于建立髋部骨质疏松动物模型。

［1］ 中华医学会骨科学分会.骨质疏松骨折诊疗指南［J］.中华骨科杂志，2008，28（10）：875-878.

［2］ Bhutani G，Gupta MC.Emerging therapies for the treatment of osteoporosis［J］.J Midlife Health，2013，4（3）：147-152.

［3］ Mazoochian F，Hölzer A，Jalali J，et al.Finite element analysis of the ovine hip：development，results and comparison with the human hip［J］.Vet Comp Orthop Traumatol，2012，25（4）：301-306.

［4］ Sheng SR，Wang XY，Xu HZ，et al.Anatomy of large animal spines and its comparison to the human spine：a systematic review［J］.Eur Spine J，2010，19（1）：46-56.

［5］ Oheim R，Amling M，Ignatius A，et al.Large animal model for osteoporosis in humans：the ewe［J］.Eur Cell Mater，2012（24）：372-385.

［6］ Augat P，Schorlemmer S，Gohl C，et al.Glucocorticoidtreated sheep as a model for osteopenic trabecular bone in biomaterials research［J］.J Biomed Mater Res A，2003，66（3）：457-462.

［7］ Schorlemmer S，Ignatius A，Claes L，et al.Inhibition of cortical and cancellous bone formation in glucocorticoidtreated OVX sheep［J］.Bone，2005，37（4）：491-496.

［8］ Lill CA，Fluegel AK，Schneider E.Effect of ovariectomy，malnutrition and glucocorticoid application on bone properties in sheep：apilot study［J］.Osteoporos Int，2002，13（6）：480-486.

［9］ Zarrinkalam MR，Beard H，Schultz CG，et al.Validation of the sheep as a large animal model for the study of vertebral osteoporosis［J］.Eur Spine J，2009，18（2）：244-253.

［10］ Goldhahn J，Jenet A，Schneider E，et al.Slow rebound of cancellous bone after mainly steroid-induced osteoporosis in ovariectomized sheep［J］.J Orthop Trauma，2005，19（1）：23-28.

［11］ Zarrinkalam MR，Schultz CG，Parkinson IH，et al.Osteoporotic characteristics persist in the spine of ovariectomized sheep after withdrawal of corticosteroid administration［J］.J Osteoporos，2012（2012）：1825-1829.

［12］ 屈波，潘显明，权毅，等.成都地区老年人骨质疏松性骨折发病特点分析［J］.中国骨质疏松杂志，2008，14（10）：733-735.

［13］ 郝永强，郝光亮，戴魁戎.上海地区骨质疏松性骨折的发病特点研究［J］.中国骨质疏松杂志，2007，13（3）：197-200.

［14］ Anastassopoulos G，Panteliou S，Christopoulou G，et al.Vibrational bone characteristics versus bone density for the assessment of osteoporosis in ovariectomized rats［J］.J Med Eng Technol，2010，34（1）：35-42.