人肺癌细胞系NCI-H1650中肿瘤干细胞的分离及鉴定＊

丁 曼，张岸梅，朱 波

（第三军医大学新桥医院肿瘤科／全军肿瘤诊治研究所，重庆400037）

作为全球发病率最高的恶性肿瘤，肺癌恶性程度高且预后差，是恶性肿瘤中致死的首要病因，对人类健康产生了严重的危害［1］。随着现代医学发展，肺癌的早期诊断和综合治疗均有一定进步，其临床疗效也有相对的改善，但多数患者在中晚期确诊而不能进行手术治疗，且肺癌对放、化疗有所抵抗，因此患者总体5年生存率低于15%［2］。肿瘤干细胞理论提出肿瘤源于肿瘤干细胞，这群细胞具有自我更新、多向分化和无限增殖的潜能，是肿瘤对放、化疗抵抗，以及肿瘤复发和转移的根源［3］。有研究表明，肿瘤干细胞可能作为一个新的靶点在临床上来进行治疗。但是，肿瘤组织中的干细胞水平极少，因此分离并鉴定肿瘤干细胞能为后续研究工作提供一个良好的基础。肺癌中同样存在这样一群干细胞，即肺癌干细胞。Ho等［4］在2007年采用侧群细胞分选法有效分选出非小细胞肺癌干细胞，证实了肺癌干细胞的存在。目前已有多种肺癌细胞株已分选出具有干细胞特性的肿瘤细胞，如H466、A549、H460等［5-7］。肺癌的发生、发展、侵袭转移、复发、耐药等均与肺癌干细胞相关，因此，能有效富集肺癌干细胞对肺癌的进一步研究尤为重要。肿瘤干细胞的分离及鉴定中，通常选用细胞表面标志物的方法。CD133是公认的经典肿瘤干细胞标志物，已在肺癌［8］、前列腺癌［9］、乳腺癌［10］、脑胶质瘤［11］、结肠癌［12］等多 种恶性肿瘤中发现。本研究采用无血清连续培养结合紫杉醇诱导干细胞的方法分离出干细胞，并用一系列肿瘤干细胞表面标志物或相关标志物鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：非小细胞肺癌细胞株NCI-H1650购自美国典型培养物收藏中心（ATCC）；主要试剂：RPMI1640培养基购自HyClone公司，胎牛血清（FBS）购自TBD 公司，0.25%胰酶、DMEM／F12 培养基购自HyClone公司，重组人胰岛素购自Sigma公司，重组人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、重组人碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自PeproTech公司，牛血清清蛋白（BSA）购自Sigma公司；紫杉醇注射液购自山西普德药业有限公司，CD133及CD326流式细胞仪抗体购自Miltenyi公司；CD133及CD326免疫荧光抗体购自Biorbyt公司，异硫氰酸荧光素（FITC）及3H-吲哚菁类染料Cy3标记的羊抗兔二抗购自碧云天公司；逆转录试剂盒及RT-PCR 试剂盒购自Takara公司；Oct4抗体、Nanog抗体及Sox-2抗体均购自Abcam 公司，β-actin抗体购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NCI-H1650细胞培养：细胞在37 ℃，5%CO2培养箱内饱和湿度条件下培养，培养液为RPMI1640，加入10%标准FBS、青霉素和链霉素。取对数生长期的细胞进行实验。细胞球培养：取NCI-H1650细胞，去掉原培养液，胰酶（0.25%）消化后用原培养液终止消化，移入离心管离心（800 r／min，5min）后弃去上清液。加入含有重组人胰岛素、EGF、bFGF、BSA 及DMEM／F12培养基的无血清培养液，制成单细胞悬液种植在6孔板中（密度为20 000个／孔），每个孔4 mL培养液。2～3d后取上清液，离心后加入无血清培养液移入新培养瓶中，细胞成球生长，6孔板中继续加入无血清培养液，2～3d后再次取上清离心后移入培养瓶，并换液及传代。成球生长细胞传代2次后，按照1×106个／mL细胞加入0.2ng／mL的紫杉醇培养，24h后离心换液。紫杉醇刺激后细胞大量死亡，换液后每天观察细胞状态，2～3d换液1次，直至细胞生长状态恢复如加紫杉醇前。实验取紫杉醇刺激后培养瓶中第5代细胞球。此过程细胞球均在37 ℃，5%CO2培养箱内饱和湿度条件下培养。

1.2.2 流式细胞检测 将不同代数的细胞球离心（1 000r／min，5min）后，调整其浓度至1×107／mL，在100μL细胞液中加入荧光素标记的CD133抗体（鼠抗人）和CD326抗体（鼠抗人）各1μg，于室温下放置30min后，用PBS离心并洗涤2次，再加入200μL PBS重悬细胞，即可上机检测CD133及CD326的阳性率。

1.2.3 免疫荧光检测 取第5 代细胞球，甩片离心（800r／min，5min），将细胞球甩片到玻片上，用冰冻的4%多聚甲醛固定20min，用PBS洗3次后使用5%BSA 封闭20min，将玻片甩干。加入兔抗人CD133一抗（1∶200）或者兔抗人CD326一抗（1∶200），置入4 ℃冰箱过夜孵育。次日，于冰箱中取出玻片，室温下放置10min，用PBS洗3次后加入FITC 标记或Cy3标记的羊抗兔二抗（1∶500），在37 ℃避光孵育30 min。之后用PBS洗3次，避光下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色3min，PBS洗3次后用抗荧光淬灭封片剂封片，最后在激光共聚焦显微镜下观察并照相。

1.2.4 RT-PCR检测 采取NCI-H1650细胞及细胞球使用Trizol法提取总RNA 后，按照Takara逆转录试剂盒及RTPCR 试剂盒说明操作。采用2-△△CT法进行分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列，见表1。

1.2.5 Western blot检测 取NCI-H1650细胞及细胞球用蛋白裂解液提取蛋白，制备成蛋白样品并用BCA 法检测蛋白水平。进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），经电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF 膜用5%BSA 在室温下封闭1h，再加入兔抗人Oct4抗体、Nanog抗体及Sox-2抗体（1∶200）、鼠抗人β-actin抗体（1∶1 000），放置于冰箱4 ℃过夜。次日用TBST 洗3次后加入对应二抗（稀释比例为1∶1 000），在37 ℃水浴锅中孵育30 min，再次用TBST 缓冲液（Tris-HCl缓冲盐溶液＋吐温溶液）洗3次后用显影剂在凝胶成像仪中曝光并记录成像。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS13.0 统计软件分析。计数资料用±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-PCR 引物序列

2 结 果

2.1 NCI-H1650细胞及细胞球培养结果 NCI-H1650细胞在有血清培养基培养下，在培养瓶底部呈梭形贴壁生长（图1A）。而在连续的无血清培养下，有少部分细胞呈圆形悬浮生长，但细胞成球较小，细胞大小基本一致，折光性较好（图1B）。经紫杉醇刺激后多次传代，悬浮生长的细胞逐渐增多，其细胞球体积也逐渐变大，第5次传代后仍保持良好的克隆形成能力（图1C、D）。表明紫杉醇刺激后连续无血清培养能成功诱导形成NCI-H1650细胞形成悬浮生长的细胞球。

2.2 免疫荧光结果 在激光共聚焦显微镜下可见，细胞质和细胞膜与FITC 标记的CD133 的二抗结合呈绿色荧光，即CD133阳性；细胞质和细胞膜与Cy3标记的CD326的二抗结合呈红色荧光，即CD326阳性；细胞核用DAPI染色呈蓝色。表明紫杉醇刺激后连续无血清培养能成功诱导形成NCIH1650干细胞，见图2。

图1 显微镜下观察NCI-H1650细胞及细胞球生长情况

图2 免疫荧光检测NCI-H1650细胞球干细胞标志（×1 200）

2.3 流式细胞结果 在NCI-H1650 细胞中，CD133＋和CD326＋双阳性细胞率仅为1.69%（图3A），而第5 次传代后的细胞球中CD133＋和CD326＋双阳性细胞率为93.20%（图3B），高于有血清培养的NCI-H1650细胞。表明采用此种方法能成功诱导NCI-H1650干细胞。

图3 流式细胞术检测干细胞标志

图4 Oct-4、Nanog、Sox-2蛋白表达水平

2.4 Western blot 结 果 与NCI-H1650 细 胞 比 较，NCIH1650细胞球中Oct4、Nanog和Sox-2的蛋白高表达，二者光密度比值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

2.5 RT-PCR 检测结果 NCI-H1650细胞的Oct4、Nanog和Sox-2的基因表达水平均低于其细胞球表达水平，见图5。

图4 Oct-4、Nanog、Sox-2的mRNA 表达水平

3 讨 论

随着从不同肿瘤中分离得到肿瘤干细胞及鉴定的证据渐多，肿瘤干细胞的理论也得到了更多人的认同。肿瘤组织由明显异质性的细胞群体构成，其中的极少细胞具有干细胞的生物学特性，即自我更新、增殖克隆、分化潜能、侵袭迁移、高致瘤性、耐药性以及对放疗抵抗性［13］。

目前，肿瘤干细胞主要根据其表面标志物进行分选和鉴定。CD133最初是作为人造血干细胞及造血祖细胞的分子标志物［14］，但越来越多的研究发现，CD133＋肿瘤细胞也具有自我更新等干细胞特性，因此也成为多种肿瘤干细胞的分子标志物，包括肝癌、胰腺癌、卵巢癌等。CD326又称上皮细胞黏附分子（EpCAM），其在肝癌、肺癌等肿瘤干细胞中呈高表达，也是目前公认的肺癌干细胞标志物之一。因此，本研究采用这两个分子标志物鉴定诱导的NCI-H1650干细胞。现已有大量报道从肺癌组织中分离干细胞，然而该方法组织来源困难，分离技术难度高，且分选出的干细胞活性不足，限制了对肺癌干细胞生物学特性的进一步研究。此外，还有大量报道用另一种肺癌细胞株A549进行体外诱导肺癌干细胞。然而NCI-H1650来源于晚期肺腺癌患者，与A549 相比具有更强的侵袭转移能力，而且NCI-H1650是EGF 受体突变细胞株，诱导其干细胞具有重要的研究价值及临床意义。

目前得到肺癌干细胞主要通过侧群细胞分选法、磁珠分选法和无血清连续培养法，但以上方法分出细胞少、价格昂贵、分选出后不易存活。本实验室曾用无血清连续培养的方法分离出卵巢癌细胞株A2780中的干细胞［15］，但应用此种方法诱导NCI-H1650干细胞得到干细胞量少，加入紫杉醇后能明显提高干细胞的富集。本研究采用连续无血清条件培养基结合药物刺激的方法培养悬浮细胞球，从而富集肺癌干细胞。本研究发现，NCI-H1650中存在极少一部分具有自我更新能力的细胞，经过无血清连续培养后可悬浮生长成为肿瘤干细胞球，其具有形成连续克隆的能力。流式检测发现这种细胞球高表达肺癌干细胞标志物CD133和CD326，同时免疫荧光染色也发现细胞球共表达CD133和CD326。为了进一步验证细胞球的干细胞特性，本研究采用RT-PCR及Western blot检测了干性标志物Oct4、Sox2 及Nanog的表达，结果发现细胞球中这3种分子的表达高于有血清贴壁培养的NCI-H1650细胞，差异有统计学意义（P＜0.05），说明使用药物联合无血清培养的方法成功诱导了NCI-H1650肺癌干细胞。肿瘤干细胞已成为肿瘤方面的研究热点，其分离和鉴定对基础及临床研究均具有重要意义。本研究采用无血清联合药物诱导培养方法，成功诱导出肺癌干细胞，为后续肿瘤干细胞的生物学特性研究奠定了一定的基础。

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