硫酸右旋糖酐抑制人胃癌腹腔种植转移及其对缺氧诱导因子-1α表达的影响＊

王红红，王 娟，金 秀，徐远义

（宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川750001）

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，而腹腔种植转移是影响患者预后及死亡最重要的原因，因此寻找一种可以抑制其种植转移的药物将会极大的提高患者的生存率。硫酸右旋糖酐（dextran sulfate，DS）是一种大分子右旋糖酐，具有腹腔吸收缓慢，毒性小，来源丰富等优点。动物实验表明，DS可以阻止B-16 黑色素瘤细胞在大网膜乳斑和腹膜上的种植，并可延长患有癌性腹膜炎小鼠的生存时间［1］。缺氧是实体性肿瘤物理微环境的基本特征之一，在缺氧微环境下，肿瘤细胞高表达缺氧诱导因子-1α（Hif-1α）［2］。目前相关研究［3］表明Hif-1α与肿瘤的发生发展具有密切的关系，在肿瘤发生发展过程中起到重要的调控作用。本研究通过免疫组织化学、逆转录（RT-PCR），在前期研究的基础上，检测通过胃癌细胞BGC-823所构建的裸鼠腹腔转移模型中Hif-1α的表达，观察DS对胃癌细胞腹腔种植转移的作用，并探讨Hif-1α在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及实验动物 人胃癌细胞株BGC-823购于北京金紫晶生物公司肿瘤细胞库。BALB／c裸鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性，体质量18～21g，4～6周龄，饲养于宁夏医科大学实验动物中心，SPF级，自由摄取无菌食物及饮水。

1.1.2 实验药品及试剂 DS购自Sigma公司，生理盐水稀释，用22μm 过滤器过滤，使其最终浓度为0.3%；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Hif-1α多克隆抗体购自Proteintech生物有限公司（1∶200稀释），山羊抗兔二抗、DAB 购自北京中山金桥生物科技有限公司；总mRNA 提取试剂盒购自Omega公司；逆转录试剂盒购自美国Frementas公司；PCR 试剂盒购自北京康为试剂科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌细胞株BGC-823从液氮中取出，于37 ℃水浴锅中快速复苏后，培养于RPMI1640 完全培养基（含10% 灭活胎牛血清）中。在37℃、5%CO2饱和湿度温箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，隔天传代。在细胞对数生长期时收集细胞，并调整细胞悬液浓度至1×107／mL备用。

1.2.2 分组、动物模型的建立 BALB／C裸鼠72只，用0.5%戊巴比妥钠50mg／kg麻醉，腹部皮肤消毒后，于腹部剑突下切约0.5cm 长切口，暴露胃壁，于胃壁后悬浮滴入0.2mL 1×107／mL的细胞悬液，关闭切口。裸鼠分为两组，一组32只，于第2天在切口附近注入1mL 生理盐水，另一组40只，于第2天切口附近注入0.3% DS 1mL。每组再分为4小组，于注入药物后的第1、3、7、14天用颈椎脱位法处死裸鼠。观察大网膜上的转移肿瘤数量、大小、颜色，取大网膜分为两份，一份用于制作蜡块，另一份冻存于-80 ℃低温冰箱中用于RT-PCR。

1.2.3 免疫组织化学 组织经10%甲醛固定，乙醇脱水后石蜡包埋，切取0.4 mm 厚组织。免疫组织化学染色采用二步法，PBS代替一抗作为阴性对照。Hif-1α于细胞核及细胞质表达，观察阳性细胞分布特点。应用IPP 图像自动分析系统，在400 倍镜下，选定空白区定标及具有代表性的5 个视野，测定光密度（OD）值进行计算，获得所选视野的平均光密度值。

1.2.4 RT-PCR 总mRNA 提取试剂盒提取总RNA，按试剂盒步骤逆转录及扩增。Hif-1α引物：正向5′-GAA AGC GCA AGT CTT CAA AG-3′，反向5′-TGG GTA GGA GAT GGA GAT GC-3′，目的片段长度为167bp，反应条件：94 ℃3min；94 ℃30s，58 ℃30s，72 ℃30s30个循环；72 ℃4min。内参GAPDH：正向5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′，反向5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3′，目的片段长度为496bp，反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s30个循环，72℃7min。PCR 产物用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照记录。将图像摄入Quantity One分析系统对扩增产物进行图像分析，以相对光密度（ROD）代表基因表达丰度，以Hif-1α／GAPDH 计算Hif-1α的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0 软件整理分析数据，计量资料以±s表示，两样本均数的比较采用两样本均数的t检验，多个样本均数的比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验组及对照组腹腔内肿瘤结节的数量 结节计数时以结节间界限较清楚记为各自独立结节。随着时间的推移，在大网膜、腹膜、肝脾均可见到瓷白色结节，质略硬，腹腔瘤结节的数量逐渐增加，3d时实验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），7、14d 时实验组较对照组数量明显减少，直径减小（P＝0.000），见图1。

图1 实验组及对照组不同时间点腹腔肿瘤结节数量

2.2 免疫组织化学法检测不同时间点实验组和对照组Hif-1α的表达 Hif-1α于细胞质及细胞核表达，1d时，实验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），3、7、14d时实验组较对照组表达明显降低（P＜0.01），见图2、表1。

图2 对照组与实验组Hif-1α免疫组织化学表达结果（×400）

2.3 RT-PCR 法检测不同时间点实验组和对照组Hif-1αmRNA 的表达 与对照组比较，实验组不同时间点Hif-1αmRNA的表达明显下调，差异有统计学意义（P＝0.000），见表2。

表1 免疫组织化学检测对照组及实验组不同时间点Hif-1α的表达（±s）

表1 免疫组织化学检测对照组及实验组不同时间点Hif-1α的表达（±s）

组别 1d 3d 7d 14d F P对照组 56.97±4.36 74.37±3.36 94.51±4.81 137.11±4.30 327.980 0.000实 验 组 53.49±2.18 67.14±3.25 82.64±3.77 87.31±4.51 95.295 0.000 t 1.577 3.456 4.338 17.881 P 0.154 0.009 0.002 0.000

表2 RT-PCR 法检测对照组与实验组不同时间点Hif-1αmRNA 表达（±s）

表2 RT-PCR 法检测对照组与实验组不同时间点Hif-1αmRNA 表达（±s）

组别 1d 3d 7d 14d F P对照组 1.18±0.47 1.63±0.34 2.63±0.44 3.61±0.41 100.964 0.000实 验 组 0.83±0.18 1.36±0.22 1.86±0.47 1.86±0.46 27.883 0.000 t 2.672 2.584 4.625 10.988 P 0.016 0.015 0.000 0.000

3 讨 论

胃癌是常见的严重危害人类健康、高发病率、高病死率的恶性肿瘤，据统计占我国消化道恶性肿瘤的第一位，目前住院病例中90%以上为进展期胃癌，即使施行根治手术，腹腔转移仍是胃癌无法手术根治的主要原因之一，也是术后复发、治疗失败的主要原因。胃癌术后腹腔化疗已作为阻止腹腔种植转移的一种常规治疗手段，普通化疗药物在腹腔容易被吸收，导致该药在腹腔停留时间短不能达到很好的抗癌作用。

本实验研究的DS相对分子质量大，约50×104，致使其在腹腔吸收缓慢，可在腹腔形成比较持久的高浓度，从而对腹腔肿瘤细胞发挥作用。国外于1997年开始研究DS 的抗癌作用。曾有研究显示，DS可以阻止B-16黑色素瘤细胞在大网膜乳斑及腹膜上的种植，可安全的使用于胃肠道吻合手术，所以DS被认为是具有潜力的抗癌药物［4］。本课题组前期研究显示，DS在体外可抑制人胃癌细胞MKN1 的黏附及整合素β1的表达［5］，体内实验亦研究显示，DS可以抑制整合素β1的表达［6-7］及VEGF的表达［8］。

Hif-1α是1992年由Ratcliffe等［9］发现的一种氧依赖转录激活因子，Hif-1主要由Hif-1α 和Hif-1β两个亚单位组成，其中Hif-1α是惟一的氧调节亚单位，主要表达在缺氧的组织细胞内［10］。缺氧是实体性肿瘤物理微环境的基本特征之一，肿瘤生长到一定阶段，当氧的需求超过供给，或肿瘤内的不成熟血管因间质内压力上升而塌陷时，局部微环境处于缺氧状态。肿瘤细胞在长期缺氧微环境刺激下，通过Hif-1α 表达增高调控血管新生，促进细胞发生上皮间质转化等途径适应缺氧微环境而促进肿瘤生长和转移［11］。

本实验通过体外实验研究发现，DS可以减少实验组裸鼠腹腔内的胃癌结节数量并减小其体积，且可有效地降低Hif-1α mRNA 及蛋白的表达，表明DS可以抑制胃癌细胞在腹腔内的转移生长，其可能是DS通过抑制Hif-1α的表达而发挥作用，使肿瘤局部缺氧状态不能得到改善，从而抑制肿瘤的生长，最终抑制胃癌细胞在腹腔的转移生长。Ardyanto等［12］用CoCl2处理不同分化程度的人胃癌细胞株，结果显示Hif-1α的表达与胃癌细胞的增殖和凋亡相关。易楠等［13］的研究发现miR-18α能作用于Hif-1α的13′UTR，抑制其蛋白表达，从而最终抑制胃癌细胞的增殖。

总之，本实验研究发现，DS可以减少实验组裸鼠腹腔内的胃癌结节数量并减小体积，且可有效地降低Hif-1αmRNA 及蛋白的表达。DS抑制胃癌细胞腹腔种植转移的机制可能是其通过下调Hif-1α的表达而发挥作用，Hif-1α在DS抑制胃癌腹腔种植转移中发挥重要作用，降低Hif-1α的表达对抑制胃癌腹腔种植转移具有重大意义。本研究发现，DS可以抑制胃癌的腹腔种植转移，可为胃癌腹腔种植转移临床治疗提供新的药物。

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