孕酮对反复自然流产小鼠白介素8表达的调节作用

宋 芳 冯若鹏 赵紫薇 陈 晶 贺 帅 陈小艳

1.包头医学院组织学与胚胎学教研室（014010）；2.包头医学院形态学实验室

妊娠期母体产生大量的雌激素、孕激素等，它们能抑制辅助性T细胞（Th）1亚群反应，促进Th2细胞亚群 反 应［1－2］。Fotiadou 等［3］和 Piccinni等［4］发现孕酮可以促进Th2型细胞亚群分泌的细胞因子，如白介素（IL）－4和IL－5的高水平表达，参与免疫调节，减少流产发生。因此，有望通过调整孕酮水平对Th1／Th2型细胞因子间的平衡进行调节，有效地降低流产率。IL－8为Th1型细胞因子，表现为免疫杀伤作用，可引发自然流产，本实验通过比较孕酮干预的 CBA／J×DBA／2 小鼠流产模型和 CBA／J×BALB／c小鼠正常妊娠模型IL－8及其mRNA的变化，探讨孕酮对自然流产小鼠IL－8的调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗人IL－8多克隆抗体为Santa Cruz公司产品；孕酮和IL－8酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒、PV－6001试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；RNA抽提试剂RNArose Reagent购于上海华舜生物工程有限公司；通用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

1.2 建立小鼠自然流产模型

将雌性CBA／J小鼠分别与雄性DBA／2或BALB／c小鼠合笼交配，次日晨检出阴栓者记为妊娠1d，分别建立自然流产模型与正常妊娠模型。于妊娠14d处死孕鼠，计算胚胎吸收率（R），以评价模型成功与否。R＝Re／（Re＋F）（Re为吸收胚胎数，F为存活胚胎数）。

1.3 实验分组

将自然流产小鼠分为两组：孕酮组和模型组，孕酮组于妊娠5d腹腔注射黄体酮溶液（2mg／kg），每日1次，维持至妊娠14d；模型组同步注射等量的生理盐水；正常妊娠小鼠不做任何处理。每组10只小鼠。

1.4 ELISA 检 测

3组孕鼠均于妊娠14d采用眼球摘除术收集血样，2000rpm／min离心10min，取血清，用 ELISA试剂盒检测孕酮及IL－8水平。以标准品2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、0pg／ml所对应的浓度作为纵坐标，OD值作为横坐标在半对数纸上作图，画出标准曲线。所有OD值均减去空白管值后再计算。根据样品OD值在该标准曲线图上查出相应样品中孕酮、IL－8的含量。

1.5 免疫组织化学染色

将符合实验条件的各组小鼠绒毛、蜕膜组织制备成石蜡切片，常规脱蜡至水；0.3%H2O2·甲醇室温孵育30min，封闭内源性过氧化物酶；滴加兔抗人IL－8抗体工作液（1∶200），4℃过夜；滴加羊抗兔IgG抗体－辣根过氧化物酶（HRP）多聚体，室温孵育30min。二氨基联苯胺（DAB）－H2O2室温显色，Mayer苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。用捷达801图像分析系统分别测定各组绒毛、蜕膜组织IL－8蛋白表达的相对含量。

1.6 RT－PCR

各组小鼠绒毛、蜕膜组织，生理盐水洗净后分别投入液氮到组织硬化，然后冻存于－80℃冰箱，以供提取RNA用。按通用RT－PCR试剂盒所示步骤，将mRNA反转录为cDNA，用所得cDNA进行PCR反应，PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，采用JeDa 801凝胶成像分析系统对DNA条带进行灰度扫描。

将同一标本IL－8DNA条带的灰度值／β-actin DNA条带的灰度值＝IL－8mRNA的相对含量

IL－8引物序列：上游引物5＇－GACAAGAGCCAGGAAGAAAC－3＇，下游引物5＇－CTACAACAGACCCACACAATAC－3＇，扩增片段长度459bp；βactin引物序列：上游引物5＇－CGGGAAATCGTGCGTGACAT－3＇，下游引物5＇－GAACTTTGGGGGATGCTCGC－3＇，扩增片段长度712bp。

1.7 统计学处理

所有数据采用SPSS 11.5软件分析处理，用均值±标准差（）表示，经方差齐性检验后，用单因素方差分析（one－way ANOVA）中的LSD法处理，并进行组间两两比较，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA 检 测

孕酮组血清孕酮水平高于模型组，而IL－8水平低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。孕酮组血清孕酮、IL－8水平与正常组比较均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组血清孕酮、IL－8水平比较（）

表1 各组血清孕酮、IL－8水平比较（）

＊与孕酮组比较P＜0.01

组别 孕酮（ng／ml） IL－8（pg／ml）孕酮组 84.91±10.05 615.23±213.62模型组 41.83±9.77＊ 1653.14±321.25＊正常组 91.27±10.91 653.87±183.43

2.2 免疫组织化学染色

在绒毛和蜕膜组织中，各组IL－8的蛋白表达主要定位在绒毛上皮细胞、蜕膜细胞及腺上皮细胞的细胞质内，呈棕黄色颗粒，阳性反应强弱不等（图1）。

图1 IL－8蛋白在各组绒毛和蜕膜组织中的表达（HRP，200×）

图像分析结果显示：孕酮组IL－8的蛋白相对含量在绒毛组织、蜕膜组织的蜕膜细胞和腺上皮细胞中均低于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.05），与正常组比较均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 各组IL－8在绒毛、蜕膜组织中的蛋白相对含量比较（）

表2 各组IL－8在绒毛、蜕膜组织中的蛋白相对含量比较（）

与孕酮组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

组别 绒毛上皮 蜕膜蜕膜细胞 腺上皮孕 酮 组 0.067±0.028 0.094±0.025 0.104±0.021模型 组 0.135±0.012＊＊ 0.107±0.024＊ 0.116±0.019＊正常 组 0.059±0.021＃ 0.088±0.022＃ 0.110±0.017＃

2.3 RT－PCR实验

2.3.1 扩增产物的定性分析 IL－8mRNA在各组绒毛、蜕膜组织中均有表达，IL－8和β-actin的RTPCR产物与理论长度一致见图2。

图2 IL－8mRNA在各组绒毛、蜕膜组织表达的RT－PCR分析

2.3.2 扩增产物的半定量分析 在绒毛组织和蜕膜组织中，孕酮组IL－8mRNA的表达均低于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.01），与正常组比较无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 各组IL－8mRNA在绒毛、蜕膜组织相对含量比较（）

表3 各组IL－8mRNA在绒毛、蜕膜组织相对含量比较（）

与孕酮组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

组别 绒毛组织 蜕膜组织孕酮组 61.28±4.13 72.14±3.04模型组 85.72±2.63＊＊ 82.23±4.11＊正常组 58.33±2.87＃ 70.55±3.66＃

3 讨论

目前，不明原因的自然流产已被公认为与机体的免疫因素有关，且Th1／Th2细胞因子平衡对正常妊娠是十分重要的。正常妊娠是以Th2型细胞因子为主的生理现象，当发生向Th1型细胞因子的偏离时，可能会导致自然流产［5－7］。IL是由多种细胞分泌的在免疫调节过程中起重要作用的细胞因子，国内外已有学者研究了自然流产患者血清或组织中IL－2、IL－4、IL－5、IL－6、IL－8、IL－10等的变化，但关于IL－8与自然流产的相关性研究的文献报道较少，Madhappan等［8］、Koumantaki等［9］以 及 国 内 学 者齐卫红［10］和黄江宁等［11］均是采用ELISA法检测反复自然流产患者血清IL－8的含量，且得出结论不一致。我们在前期工作中采用RT－PCR、Western blot和免疫组织化学染色技术在自然流产母胎界面进行研究，发现并报道：反复自然流产患者绒毛、蜕膜组织中IL－8mRNA和蛋白表达水平明显高于正常妊娠妇女，提示IL－8参与反复自然流产的病理过程。然而引发自然流产的免疫机制相当复杂，Th1／Th2型细胞因子间的平衡受多种因素的调控，如何调节正常的免疫平衡，维持正常妊娠的进行，减少流产的发生是关键，因此，有必要进一步研究引发自然流产的调节机制。

众所周知，蜕膜的正常生长和发育对妊娠的维持起着相当重要的作用，而孕酮是维持早孕期蜕膜正常形态和功能的必要激素。由于临床研究受到患者遗传背景、生活习惯、工作环境等诸多复杂因素的影响，而采用近交系小鼠可以排除混杂因素，CBA／J和DBA／2是较为常用的近交品系小鼠。CBA／J×DBA／2小鼠具有反复自然流产的特点，胚胎吸收率恒定于30%～45%，而CBA／J×BALB／c小鼠的胚胎吸收率仅为5%～10%。目前普遍认为，免疫因素是这一动物模型发生自然流产的主要原因，因此它们是用于研究母胎免疫调节机制较为理想的动物模型［12－13］。

ELISA实验结果表明：外源性给予黄体酮的自然流产小鼠，其血清孕酮水平明显升高，而IL－8水平明显降低，且血清孕酮、IL－8水平与正常组比较差异均无统计学意义。由此可见，孕酮对IL－8产生抑制作用，从而减少中性粒细胞侵入蜕膜组织，可以保证妊娠的顺利进行。同时，免疫组化染色和RTPCR结果显示：在绒毛组织中，外源性给予黄体酮的自然流产小鼠IL－8的蛋白和mRNA相对含量明显降低，与正常孕鼠比较无显著性差异；在蜕膜组织中，外源性给予黄体酮的自然流产小鼠IL－8蛋白和mRNA相对含量也降低，并接近正常孕鼠的水平。

因此推测，孕酮通过下调IL－8表达来减少自然流产的发生和发展，此研究可为防治反复自然流产提供一定的理论依据。

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