mircoRNA-21在胃癌患者血浆中的表达及其与外周血Th1与Th2细胞关系

凌萌智　黄治国　刘扬河(海南省干部疗养院内科，海南　海口　5700)

mircoRNA-21在胃癌患者血浆中的表达及其与外周血Th1与Th2细胞关系

凌萌智黄治国1刘扬河
(海南省干部疗养院内科，海南海口571100)

〔摘要〕目的探讨microRNA(miRNA) -21在胃癌患者胃癌组织及血浆中的抑癌症机制及与外周血Th1/Th2细胞的关系。方法选取该院胃癌患者(40例)为研究组，同期来我院体检的健康人群(40例)为对照组，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测胃癌组织和对应癌旁组织以及两组血浆中miRNA-21的表达水平。采用流式细胞术检测患者外周血中Th1、Th2细胞亚群的水平，探讨其与miRNA-21表达的关系。结果miRNA-21在胃癌组织中的表达水平显著高于对应的癌旁组织(均P＜0.05) ;研究组miRNA-21的表达水平亦显著高于对照组(P＜0.05)。Spearman相关分析显示，胃癌组织及血浆中miRNA-21表达与胃癌的TNM分期呈显著正相关(均P＜0.05) ;而胃癌癌旁组织中miRNA-21表达水平与TNM分期无显著相关性(P＞0.05)。Pearson相关分析结果显示，胃癌患者血浆中miRNA-21表达与外周血中Th1细胞呈显著负相关，而与外周血中Th2细胞显著正相关(均P＜0.05)。结论miRNA-21在胃癌组织中及血清中的表达明显高于对应癌旁组织，miRNA-21具有显著的促癌功能，其促癌的机制可能与影响体内Th1/Th2失衡有关。

〔关键词〕microRNA-21;胃癌; Th1; Th2

1海口市人民医院消化内科

第一作者:凌萌智(1979-)，男，主治医师，主要从事消化内科方面的研究。

目前，胃癌的发病机制尚未完全明了。MicroRNA(miRNA)在肿瘤致病过程中发挥着重要的调节功能，在肿瘤组织中异常表达，且与肿瘤的分化有着密切关系〔1〕。有研究已经发现miRNA-21在甲状腺乳头状癌、肝癌等恶性肿瘤中表达异常，且与肿瘤分级呈正相关〔2～4〕。miRNA-21在胃癌组织以及血浆中的含量以及其对胃癌的可能影响机制的研究较少。本研究拟探讨miRNA-21促进胃癌的机制。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2012年11月至2014年6月来本院行胃癌手术的40例肿瘤组织标本，同时取癌旁组织;其中男21例，女19例，年龄54～74〔平均(64.13±6.21)〕岁，术前未做过任何放疗及化疗。对照组为同期健康体检人群40例，其中男23例，女17例，年龄61～75〔平均(65.33±9.62)〕岁。

1.2主要试剂组织及血浆中的RNA采用上海英骏公司Trizol试剂盒提取; cDNA逆转录试剂盒购于美国Femantes公司; PCR试剂盒以及DEPC水均购于南京生兴生化科技有限公司。miRNA-21 mimic及U6内参的引物均由广州锐博生物科技有限公司设计并提供。

1.3组织以及血浆标本总RNA提取及逆转录反应40例研究者于手术中取胃癌及对应癌旁组织。此外，清晨空腹时抽取各实验对象外周静脉血5 ml，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂(南京生兴)，2 h内于4℃，4 000 r/min离心5 min，离心后提取上层血浆备用。取约80 mg组织或200 μl血浆，加入1 ml Trizol充分匀浆后，按照说明书的要求抽提总RNA，所得RNA溶于20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量。进一步采用Femantes逆转录试剂盒对所得RNA逆转录成cDNA，于－20℃保存备用。本实验PCR反应条件: 95℃变性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s进行40个循环。采用ABI公司的7900型号Real-Time PCR仪器进行PC分析，结果采用2－ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.4流式检测外周血Th1、Th2细胞亚群外周血红细胞裂解后，采用完全1640培养液调节浓度至1×106细胞/ml。在反应体系中加入1 μg/ml PMA、50 μg/ml离子霉素及1 μl/ml Golgistop，置培养箱中培养5 h。然后用2 ml磷酸盐缓冲液(PBS) 洗1遍并重悬于100 μl PBS中，加入CD3e-APC(0.08 mg/ml) 和CD4-FITC(0.4 mg/ml)抗体，混匀后室温避光孵育20 min。以2 ml PBS洗1遍，加入100 μl Fix/Perm A液并于室温避光孵育20 min。离心清洗后加入100 μl Fix/Perm B液重悬细胞后，再加入抗干扰素(IFN) -γ-PE(0.1 mg/ml)及白细胞介素(IL) -14-PE(0.1 mg/ml)抗体，置4℃避光孵育30 min。用PBS洗1遍后，以400 μl PBS重悬细胞后，采用用流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)检测分析。

1.5统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行t检验、Spearman相关分析以及Pearson相关分析。

2　结果

2.1胃癌组织及对应癌旁miRNA-21 mRNA的表达水平与癌旁组织(1.32±0.33)比较，miRNA-21在胃癌组织中的表达水平(4.01±0.61)显著增加(t=35.20，P＜0.05)。

2.2胃癌患者血浆中miRNA-21 mRNA的表达水平与正常人群(1.21±0.41)比较，miRNA-21在胃癌患者血浆中mRNA表达水平(4.41±0.48)显著增加(t=29.33，P＜0.05)。

2.3胃癌组织及血浆中miRNA-21表达水平与胃癌组织病理分级关系Spearman相关分析结果显示，胃癌组织、血浆中miRNA-21 mRNA表达水平与胃癌的TNM分化程度呈显著正相关(r = 0.674，0.681，均P＜0.05)。而胃癌的癌旁组织中miRNA-21 mRNA表达水平与TNM分化程度无显著相关性(r= 0.249，P＞0.05)。见表1。

表1　组织和血浆中miRNA-21 mRNA表达与胃癌TNM分级的关系(±s)

表1　组织和血浆中miRNA-21 mRNA表达与胃癌TNM分级的关系(±s)

TNM分级n　　胃癌组织　　癌旁组织　　胃癌血浆Ⅰ　5　 1.33±0.32　 1.15±0.24　 1.41±0.36Ⅱ　9　 2.03±0.37　 1.09±0.23　 2.95±0.42Ⅲ　14　 4.89±0.56　 1.41±0.42　 4.72±0.59Ⅳ　12　 6.48±0.71　 1.35±0.53　 7.19±0.83

2.4胃癌血浆中miRNA-21表达水平与外周血Th2的关系Pearson相关分析结果显示，胃癌患者血浆中miRNA-21 mRNA表达水平与胃癌患者外周血Th1细胞呈显著负相关(r=0.554，P＜0.05)，而与Th2细胞呈显著正相关(r=0.572，P＜0.05)。

3　讨论

miRNA是一类全长为19～25 nt的单链小分子RNA，广泛存在于组织、血清、血浆及其他体液中，并且在体内表达比较稳定。该分子本身不具有蛋白编码功能，但对编码蛋白基因的mRNA有重要调控作用〔5〕。

以往大量的研究认为miRNA表达异常和肿瘤的发生密切相关，其通过对机体内抑癌或者促癌基因起着极其重要的调控作用〔6〕。目前，大量的研究认为miRNA-21在胰腺癌、结肠癌、口腔癌等癌症组织中表达增加，表明miRNA-21可能在恶性肿瘤中起着重要的抑癌功能〔5〕。Chan等〔7〕用RT-PCR技术检测了37例胃癌组织标本，发现有34例患者miRNA-21表达水平明显高于正常胃组织。本研究结果证实了上述miRNA-21癌基因的作用。此外，本研究还进一步证实了miRNA-21在胃癌发生发展中可能的促进作用。

进一步相关分析结果显示，miRNA-21可能影响着胃癌患者癌细胞的增殖能力和恶性程度，从而也提示了miRNA-21胃癌的诊断、分级以及预后评价可能起着潜在的重要作用。Meng等〔8〕学者在分析肝癌组织表达谱时发现miRNA-21高表达，且与肝癌组织的分级呈现显著正相关，这也进一步佐证了本研究结果。有研究显示，Th1以及Th2细胞的比例在胃癌的发生、发展中发挥重要的作用，其中Th1细胞具有抑制肿瘤生存的特征，而Th2细胞则能够促进肿瘤生长〔9〕。本研究提示miRNA-21可能是通过影响患者体内Th1/Th2平衡来促进肿瘤的生长。综上所述，miRNA-21在胃癌的发生、发展中起着重要的作用，可能的机制是通过使得机体Th1/Th2平衡向Th2偏倚来实现的。miRNA-21的检测对于对胃癌患者的临床治疗以及预后具有一定的指导意义。

4　参考文献

1 Lu J，Getz G，Miska EA，et al．MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕．Nature，2005; 435(7043) : 834-8.

2 Wang Z，Han J，Cui Y，et al．Circulating microRNA-21 as noninvasive predictive biomarker for response in cancer immunotherapy〔J〕．Med Hypotheses，2013; 81(1) : 41-3.

3Stintzing S，Lenz HJ.MicroRNA-21 in colorectal cancer:“Just another brick in the wall”〔J〕．J Natl Cancer Inst，2013; 105(12) : 840-1.

4 Chung WM，Chang WC，Chen L，et al．MicroRNA-21 promotes the ovarian teratocarcinoma PA1 cell line by sustaining cancer stem/progenitor populations in vitro〔J〕．Stem Cell Res Ther，2013; 4(4) : 88.

5 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets〔J〕．Cell，2005; 120(1) : 15-20.

6 Jiang J，Gusev Y，Aderca I，et al．Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection，cirrhosis，and patient survival〔J〕．Clin Cancer Res，2008; 14(2) : 419-27.

7 Chan SH，Wu CW，Li AF，et al．miR-21 microRNA expression in human gastric carcinomas and its clinical association〔J〕．Anticancer Res，2008; 28(2A) : 907-11.

8 Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al．MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕．Gastroenterology，2007; 133(2) : 647-58.

9 Hong S，Qian J，Yang J，et al．Roles of idiotype-specifict cells in myeloma cell growth and survival: Th1 and CTL cells are tumoricidal while Th2 cells promote tumor growth〔J〕．Cancer Res，2008; 68(20) : 8456-64.

〔2015-01-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4475-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.024