六味地黄丸抑制H2O2诱导的PC-12细胞凋亡的作用机制

高海宁　王艳杰　赵丹玉　崔　勇　柳　春(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁　沈阳　0032)

六味地黄丸抑制H2O2诱导的PC-12细胞凋亡的作用机制

高海宁1王艳杰赵丹玉崔勇柳春
(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳110032)

〔摘要〕目的探讨经典名方六味地黄丸对H2O2所致PC12细胞凋亡时bax、caspase-8和bcl-2基因和蛋白表达的调控作用。方法把大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC-12)细胞分为4组:对照组、模型组、六味地黄丸组、维生素(Vit) E组。待细胞培养24 h贴壁后吸去培养液，对照组和模型组都加入含10％大鼠血清培养液，六味地黄丸组和VitE组分别加入含10％六味地黄丸大鼠血清培养液和含VitE的培养液，预保护24 h后，除对照组之外的各组加入H2O2终浓度为200 μmol/L，对照组加入等量的培养液，继续孵育24 h后离心收集细胞，提取总RNA和蛋白。应用RT-PCR和Western印迹方法分别测定bax、caspase-8、bcl-2基因和蛋白质表达的变化。结果六味地黄丸能下调bax、caspase-3基因和蛋白的表达，对bcl-2基因和蛋白表达有上调作用。结论六味地黄丸能通过有效降低bax、caspase-8基因和蛋白表达，提高bcl-2的表达，抑制、阻止PC-12细胞凋亡，促进细胞存活。

〔关键词〕六味地黄丸; PC-12;细胞凋亡

1沈阳体育学院运动人体科学学院

第一作者:高海宁(1979-)，女，副教授，在读博士，主要从事运动生理学研究。

神经元变性丢失、大量老年斑(SP)及神经纤维缠结(NFT)形成是阿尔茨海默病(AD) AD的主要病理改变，同时伴有弥漫性大脑皮层萎缩〔1，2〕。细胞凋亡在AD患者神经元的丢失中扮演重要角色，与AD的发生、发展关系密切〔1，2〕。神经细胞损伤是不可复原的，越来越多的证据认为，氧化应激是导致神经元凋亡和坏死的重要原因〔3，4〕。H2O2是活性氧簇(ROS)的一种重要形式，作为机体正常有氧代谢的产物，在浓度过高时产生氧化应激，引起组织和细胞的损伤。H2O2通过几种不同的分子机制诱导细胞凋亡。本研究通过H2O2诱导PC-12细胞凋亡，从分子学水平探讨六味地黄丸对改善AD发生的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞，高分化，购于中国科学院上海生命科学研究所生化与细胞所; H2O2(35％ W/W水溶液)，购于阿法埃莎(天津)化学有限公司; DMEM高糖培养基、双抗、胰酶，购于Hyclone公司; TaKaRa RNA PCR试剂盒(AMV) Ver.3.0及bax、caspase-3、bcl-2引物购于TaKaRa大连宝生物公司; BCA蛋白质测定试剂盒购于碧云天生物科技研究所; DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。1.2实验仪器水套二氧化碳培养箱(Thermo Scientific Forma SeriesⅡ，美国) ;生物安全柜(HFsafe-1200，上海力申科技有限公司) ;酶标仪(美国BIO-RAD iMark) ;凝胶成像分析仪(WD-9413B，北京市六一仪器厂) ;梯度PCR仪(MycyclerTM Thermal Cycle，美国BIO-RAD) ;高速台式冷冻离心机(TGL-20M，长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.3六味地黄丸含药血清制备大鼠按体重随机分为对照组和六味地黄丸组，生药质量浓度为0.75 kg/L，水溶液按10 ml/kg六味地黄丸水溶液灌胃，每天2次，空白组给予同体积双蒸水灌胃，连续给药7 d，第7天首次给药1.5 h后腹主动脉取血，静置2 h，2 000 r/min离心10 min后分离血清。经56℃，30 min灭活，0.22 μm滤膜过滤灭菌，－20℃保存备用。

1.4细胞的培养PC12细胞用DMEM高糖培养基接种于细胞培养瓶中。在37℃，5％CO2培养箱中培养，根据细胞生长的情况，2～3 d按照1∶3的比例传代一次，采用对数生长期的细胞进行实验。

1.5实验分组及步骤含药血清浓度10％为最佳浓度，含药血清作用预保护24 h。因此，将细胞按5×105/ml密度接种于培养瓶内，每瓶加培养基3 ml，取对数生长期的PC12细胞计数分四组，37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24 h贴壁后，对照组的培养基换为含有10％浓度蒸馏水灌胃雄性大鼠血清预保护24 h;模型组培养基同样换成含有10％浓度蒸馏水灌胃雄性大鼠血清预保护24 h后加入H2O2终浓度为200 μmol/L;六味地黄丸组培养基换为含有10％浓度六味地黄丸灌胃雄性大鼠血清预保护24 h后加入H2O2终浓度为200 μmol/L; VitE组培养基换为含有20 μmol/L VitE和10％浓度蒸馏水灌胃雄性大鼠血清预保护24 h后加入H2O2终浓度为200 μmol/L。24 h后提取各组总RNA和蛋白，深温冰箱保存待检。

1.6RT-PCR检测Bax mRNA、caspase-8 mRNA和bcl-2 mRNA各组细胞加药处理结束后，提取细胞总RNA，分别测定并计算A260 nm/280 nm值及其比值，以鉴定纯度。随后用RT-PCR试剂盒进行逆转录及聚合酶链反应(PCR)。引物由TaKaRa大连宝生物公司合成。β-actin引物序列:上游引物: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3';下游引物: 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，PCR产物序列长度为592 bp。bcl-2引物序列:上游: 5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAGA-3';下游: 5'-AGTCATCCACAGAGC GATGTT-3'，扩增产物的DNA全长为446 bp。bax引物序列:上游: 5'-CATCTCCTTCATCCTTGCTG-3';下游: 5'-CCAGCC ACAAAGATGGTCACT-3'，扩增产物的DNA全长为337 bp。caspase-8引物序列:上游: 5'-CCCGTGAAGCAAGGATTT-3';下游: 5'-ACTGTGGGTCTGGGAAGC-3'，扩增产物的DNA全长为488 bp。反应参数:热启动94℃预变性2 min; 94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环。72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳，WD-9413B凝胶成像分析仪进行拍照、图像分析。

1.7Western印迹检测Bax、caspase-8和bcl-2的蛋白表达收集各组细胞用细胞裂解液裂解，12 000 r/min，4℃离心10 min，用BCA试剂进行蛋白定量。以四组中提取蛋白浓度最小组为基础，其余三组蛋白稀释，使四组蛋白浓度一致后，取各组蛋白样品各100 μl，加入5×上样缓冲液25 μl，100℃煮5 min，冷却后，每泳道上样量30 μl，10％SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5％脱脂牛奶的TBST 37℃下封闭2 h，1∶1 000加入Bax、caspase-8、bcl-2及β-actin的一抗于4℃过夜，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，加入相应的二抗37℃孵育2 h后，TBST快洗膜3次，慢洗3次，每次5 min，使用DAB显色剂显色，结果用图像分析仪分析，以面积和光密度的乘积为积分光密度表示。

1.8统计学方法应用SPSS10.0统计软件进行one-way ANOVA分析。

2　结果

与对照组相比，模型组H2O2作用24 h后，bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值显著升高，即其含量显著升高(P＜0.01)，而六味地黄丸组和VitE组预保护24 h之后，与模型组相比bax和caspase-8 mRNA和蛋白平均光密度值均有显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。与对照组相比，模型组H2O2作用24 h后，bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值显著降低，即其含量显著降低(P＜0.01)，而六味地黄丸组和VitE组预保护24 h之后，与模型组相比bcl-2 mRNA和蛋白平均光密度值均有显著升高(P＜0.01)。见表1、表2和图1、图2。

表1　各组PC-12细胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表达(±s，n=6)

表1　各组PC-12细胞中bax、caspase-8及bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表达(±s，n=6)

与对照组比较: 1) P＜0.01;与模型组比较: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

组别　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin对照组　0.262±0.048　 0.293±0.061　 0.427±0.035模型组　0.448±0.0321)　0.478±0.0411)　0.254±0.0741)六味地黄丸组　0.351±0.0343)　0.367±0.0543)　0.333±0.0822)VitE组　0.346±0.0123)　0.394±0.0822)　0.309±0.0452)

图1　各组PC-12细胞中bax mRNA、caspase-8 mRNA、bcl-2 mRNA及β-actin mRNA表达

表2　各组PC-12细胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表达(±s，n=4)

表2　各组PC-12细胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白表达(±s，n=4)

与对照组比较: 1) P＜0.01;与模型组比较: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

组别　bax/β-actin　 caspase-8/β-actin　 bcl-2/β-actin对照组　0.242 7±0.003 5 0.161 8±0.020 7 0.108 4±0.009 6模型组　0.124 8±0.012 71)0.085 1±0.009 11)0.165 9±0.014 71)六味地黄丸组0.201 4±0.015 93)0.147 1±0.024 13)0.120 8±0.020 13)VitE组　0.198 9±0.020 73)0.148 3±0.016 03)0.134 4±0.008 62)

图2　各组PC-12细胞中bax、caspase-8、bcl-2及β-actin蛋白的表达

3　讨论

六味地黄丸的记载始见于宋代名医、儿科专家钱乙的《小儿药证直诀》，用来治疗小儿先天不足、发育迟缓等病症，是滋阴补肾的传统基础方剂。组成:熟地黄24 g，山萸肉、淮山药各12 g，泽泻、茯苓、丹皮各9 g。Bax和bcl-2都属于bcl基因家族，Bax能诱导细胞凋亡而促进细胞死亡，bcl-2阻断细胞凋亡而促进细胞存活。Bax与bcl-2功能相反，bcl-2和Bax的表达强度决定细胞命运〔5〕。神经细胞是一种已停止分化并长期存活的细胞，其损伤是不可复原的。PC-12细胞在H2O2诱导下，细胞内Bax占优势，促进细胞凋亡的发生发展。本文说明六味地黄丸和VitE通过阻止bax的表达来诱导细胞凋亡而促进细胞死亡，并促进bcl-2的表达来阻断细胞凋亡而促进细胞存活，从而减少H2O2诱导的细胞凋亡。

另外大量研究显示，细胞凋亡过程与caspase底物的切割密切相关〔6〕。caspase家族中有6种被认为肯定参与了细胞凋亡的过程，即caspase-3、-6、-7、-8、-9和-10。通常caspase-8介导死亡受体通路的细胞凋亡。有报道caspase-8能切割bcl家族成员从而激活一系列连锁反应，最终促进caspase-3活化，发挥促凋亡作用。本文说明PC-12细胞内caspase-8含量降低，从而减少H2O2诱导的细胞凋亡。

AD的病因在于肾中精气不足，现代研究表明六味地黄丸主治“肾怯，神不足”，具有抗衰老及抗氧化作用，对于老年痴呆、神经衰弱及健忘均有良好疗效。六味地黄丸改善AD发生是通过有效降低Bax、caspase-8基因和蛋白表达，提高bcl-2的表达，从而抑制氧化应激导致的神经元凋亡和坏死，起到延缓衰老的作用。

4　参考文献

1张均田.老年痴呆的发病机制及治疗策略〔M〕．北京:人民卫生出版社，2002: 16-29.

2 Smitha MA，Zhua XW，Tabatonb M，et al.Increased iron and free radical generation in preclinical alzheimer disease and mild cognitive impairment 〔J〕．J Alzh Dis，2010; 19(1) : 363-72.

3率红莉.阿尔茨海默病临床药物研究综述〔J〕．中国药师，2013; 12 (8) : 1139-41.

4李玲玲，刘蓉，叶兰，等.抗氧化剂在阿尔茨海默病治疗中的地位和临床应用前景〔J〕．国际神经病学神经外科学杂志，2009; 36(6) : 270-4.

5王彤，刘存志，刘玉珍，等.Bcl-2/bax基因调控机体细胞凋亡的机制研究进展〔J〕．中国老年学杂志，2008; 28(16) : 1658-60.

6 Zhu YS，Chen Q.Mitochondria and apoptosis regulation〔J〕．Chin Bull Life Sci，2008; 4(20) : 506-13.

〔2014-03-21修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者:柳春(1963-)，女，教授，博士，博士生导师，主要从事中医药对脏腑功能调控作用的信号转导机制研究。

基金项目:辽宁省科学技术规划项目(No．2012225018) ;沈阳体育学院重点学科建设项目(XKFX1511)

〔中图分类号〕R365

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4437-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.008