黑逍遥散对Aβ25～35诱导AD模型大鼠脑组织神经递质及海马病理改变的影响

2015-03-05吴红彦李海龙顾静兰美华王虎平车敏邓健男甘肃中医学院甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室甘肃兰州70000

中国老年学杂志 2015年16期

吴红彦李海龙顾　静兰美华王虎平车　敏邓健男(甘肃中医学院甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃　兰州　70000)

吴红彦1李海龙1顾静1兰美华2王虎平1车敏1邓健男3
(甘肃中医学院甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室，甘肃兰州730000)

〔摘要〕目的观察黑逍遥散对Aβ25～35诱导阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆能力改善作用、脑组织乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转移酶和(ChAT)、单胺氧化酶(MAO)及海马病理改变的影响，探讨黑逍遥散防治AD的作用及其机制。方法110只SD大鼠先随机挑选16只为假手术组，余下作为造模组，经过7 d的水迷宫实验，剔除记忆力异常的大鼠。造模组再按随机数字表分为模型组、阳性对照组及黑逍遥散高、中、低剂量组。采用Aβ25～35海马区注射诱发大鼠AD模型;高、中、低剂量组分别按4.25、8.50和17.0 g·kg－1·d－1灌胃给药，阳性对照组给予哈伯因(0.02 mg·kg－1·d－1)灌胃，每组14只，给药时间持续28 d。Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力的变化，最后一次水迷宫后，处死大鼠，收集大鼠海马及血液样本。ELISA法测大鼠脑匀浆AchE、ChAT、MAO活性; HE染色法观察海马病理损伤;电镜观察各组大鼠海马组织超微结构的变化。结果黑逍遥散能改善Aβ25～35所致AD模型大鼠行为学功能，提高学习和记忆能力;降低AD大鼠脑组织AchE和MAO活性、升高ChAT活性(P＜0.05) ;改善Aβ25～35所致AD模型大鼠AD大鼠海马病理损伤。结论黑逍遥散改善AD大鼠学习记忆力、保护AD模型大鼠脑组织结构和功能，这可能与其调节胆碱能和单胺类神经元神经递质有关。

〔关键词〕黑逍遥散;阿尔茨海默病; Aβ25～35;神经递质

1甘肃省中药新产品创制工程实验室

2阳江市中医院3武汉市中医院

第一作者:吴红彦(1963-)，男，教授，博士生导师，主要从事方剂药理与新药开发研究。

Effects of Heixiaoyao powder on the expressions of AchE，ChAT and MAO of hippocampus tissue and serum in Alzheimer＇s disease rat model induced by Aβ25～35fragments

WU Hong-Yan，LI Hai-Long，GU Jing，et al.
Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

【Abstract】Objective To explore the influence of Heixiaoyao powder on learning and memory ability，cerebral neurotransmitters and the pathological changes of hippocampus tissue in Alzheimer＇s disease(AD) rats induced by Aβ25～35．Methods The SD rats were randomly divided into sham surgery rats and model groups，and all rats of model group were given water maze tests for 7 days．These eligible rats were randomly divided into model，positive control，Heixiaoyao powder high，medium and low dose groups，14 rats in each group．Aβ25～35fragments was injected into the hippocampus to make the rat’s AD mode1．All rats of Heixiaoyao powder group were orally administered Heixiaoyao powder at low，medium and high doses(4．25，8．50，17．0 g·kg－1·d－1)，the positive control group was orally given huperzine A solution 0.02 mg ·kg－1·d－1，model and sham groups were given equal volume double distilled water daily for 28 d．The learning and memory ability of rats were detected by Morris water maze; brain homogenate stration of AchE，ChAT，MAO were examined by chemistry chromatometry．After the last administration，the rats were sacrificed and the serum and hippocampus homogenate stration of AchE，MAO，ChAT were examined by ELISA．Results Heixiaoyao powder improved the behavioral function of AD rats induced by Aβ25～35．Compared with those of model group，Heixiaoyao powder obviously decreased the activities of AchE and MAO and increased the active of ChAT in brain tissue(P＜0．05)．Conclusions Heixiaoyao powder could improve the learning and memory ability of AD rats，and the effect might be related to regulating the levels of cholinergic transmitter and cerebral monoamine neurotransmitters．

【Key words】Heixiaoyao powder; Alzheimer＇s disease; Aβ25～35fragments; Neurotransmitters

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经系退行性病变。神经递质在AD中的改变及其在AD中的地位是研究AD的一个重要方面。我们曾报道逍遥散具有显著改善AD模型小鼠学习记忆能力、增强小鼠认知、判断能力以及调节脑内相关神经递质的作用〔1，2〕，本实验采用黑逍遥散干预Aβ25～35诱导的AD大鼠模型〔3〕，以Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力的变化;酶联免疫分析(ELISA)法测大鼠脑匀浆乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和单胺氧化酶(MAO)活性; HE染色法观察海马病理损伤;电镜观察各组大鼠海马组织超微结构的变化，探讨黑逍遥散防治AD的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级SD大鼠110只，体重(200±20) g，鼠龄4～5个月，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，符合SPF级实验动物标准，实验动物使用许可证号: SYXK(甘) 2011-0001，使用实验动物质量合格证编号: scxk(甘) 2011-0001-0001058。

1.2药物黑逍遥散各组成生药由甘肃中医学院附属医院药房提供，各药用量按2010版《中国药典》比例，熟地∶柴胡∶当归∶白芍∶茯苓∶白术∶生姜∶甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1。采用传统水煎法，加中药10倍量的冷水浸泡3 h，然后加热煮沸1 h，加入薄荷再煎5 min，滤出煎液，药渣中再加6倍量水煮沸1 h，滤出煎液，合并两次煎液，80目筛滤过，滤液水浴蒸发浓缩，分别制成浓度为含生药量2.0、1.0、0.5 g/ml的黑逍遥散水煎液。石杉碱甲片(哈伯因)由河南太龙药业股份有限公司生产(国药准字HIO940156，生产批号110402)，用双蒸水配制成0.002 mg/ml水溶液，4℃冰箱中备用。Aβ25～35由上海强耀生物科技有限公司提供(批号: 20110609)。Aβ25～3510 μg溶于无菌生理盐水1 μl，使用前37℃下孵育1 w，使其呈凝聚态备用。

1.3主要试剂大鼠AchE检测试剂盒(批号: 20111206)、ChAT ELISA检测试剂盒(批号: 20111206)及MAO ELISA检测试剂盒(批号: 20111206)均购于上海晶天科技有限公司。

1.4模型复制各模型大鼠经腹腔注射3％戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》定位方法，大鼠固定于立体定位仪上，确定海马区注射点:前囟后3 mm，中线向左右各旁开2.2 mm，硬脑膜下2.8 mm。用牙科钻在颅骨上钻孔(直径约1 mm)，用微量进样器在两侧各缓慢注射Aβ25～35溶液1 μl，5 min内注射完，留针5 min，牙科泥封住颅骨孔，术区滴庆大霉素，缝合皮肤并消毒，假手术组注入等量生理盐水，其余同模型组。单笼饲养至大鼠完全清醒。

1.5动物分组大鼠称重，先按随机数字表挑选16只大鼠作为假手术组，其余大鼠手术7天后进行水迷宫测试，根据测试结果，以假手术组平均逃避潜伏期为标准，从手术造模大鼠中筛选出大于此值的学习记忆障碍大鼠，剔除不合格大鼠17只。大鼠称重，再按照随机数字表法将大鼠分为5组，分别为模型组、阳性对照组、黑逍遥散高、中及低剂量组，每组14只。假手术组大鼠也为14只。因为麻醉、手术操作不当等原因，大鼠死亡9只。

1.6动物给药低、中、高剂量黑逍遥散各组大鼠分别按4.25、8.50、17.0 g·kg-1·d-1灌胃给药;阳性对照组给予哈伯因溶液0.02 mg·kg-1·d-1灌胃;模型组、假手术组给予等容量双蒸水，每日上午1次，连续灌胃治疗28 d。中剂量组动物给药剂量按照人的临床给药剂量的相应倍数折算。

1.7Morris水迷宫测试

1.7.1定位航行实验用于测量大鼠对水迷宫的学习记忆能力。第1天让大鼠自由游泳，上、下午各训练1次。第2天开始正式对各只大鼠进行Morris水迷宫测试。安全平台放置于水迷宫中一固定象限，离池壁20 cm。在测试前给大鼠头部涂抹黄色的苦味酸作标记，向水迷宫水池中加入适量白色素二氧化钛粉，搅拌，再加自来水至水面高出安全平台1 cm，使池水为不能明显见到安全平台的不透明乳白色。水温保持在24℃～25℃。实验室保持安静，窗户遮以不透光窗帘，室内以恒定日光灯照明，亮度均等，水池周围参照物在进行水迷宫实验的几天时间内位置保持不变，大鼠游泳时实验者穿着工作服。将大鼠面向池壁放入水中，每天测试1次，每只每次测试120 s，连续5 d，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在120 s内未找到平台，须将其引至平台，让其在平台上停留15 s，这时逃避潜伏期记为120 s。每次测试时若大鼠在120 s之内找到平台，也让其在平台上停留15 s，这样结束一次测试。

1.7.2空间搜索实验用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力。在测试第6天，撤除水下平台，让大鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台。随机选取一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠限时游120 s，记录其在120 s内游过原平台相应位置的次数。

1.7.3标本制备和指标检测治疗28 d后采集标本。取血后断头处死大鼠，并立即在冰台上开颅，快速取出大脑，除去脑干和小脑。取右侧脑组织，称重。将脑组织用冰冷的生理盐水漂洗后，用滤纸拭干，用精密天平准确称重。用脑组织重量9倍的0.9％生理盐水和脑组织一起放入电动匀浆机研碎(在冰水中进行)，配成10％的组织匀浆液4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液，置4℃冰箱保存，按照试剂盒说明书进行AchE、ChAT、MAO的测定。

1.7.4病理切片制备大鼠断头处死，低温条件下快速剖取脑组织，除去脑干和小脑，定位于海马，一半脑组织放置于4％多聚甲醛溶液中固定，以备做HE染色。部分海马取材1 mm3大小，3％戊二醛固定2 h，以备做透射电镜检测。

1.8统计学处理应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2　结果

2.1Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力的变化治疗前，各组与假手术组结果比较差异均显著(P＜0.05)。治疗后第28天，模型组治疗前后潜伏期比较差异无显著性意义(P＞0.05)。而黑逍遥散各剂量组、阳性对照组与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。与阳性对照组相比，治疗后，黑逍遥散低剂量组学习潜伏时间延长(P＜0.05) ;中剂量组学习潜伏时间与之相当，无显著性差异(P＞0.05) ;高剂量组潜伏时间显著减少(P＜0.05)。自身比较，治疗后与治疗前相比，黑逍遥散各剂量组、阳性对照组的潜伏期均减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1　不同时期大鼠Morris水迷宫实验潜伏期(±s，n=14)

与假手术组比较: 1) P＜0.05;与模型组比较: 2) P＜0.05，;与阳性对照组比较: 3) P＜0.05;与同组治疗前相比: 4) P＜0.05;下表同

组别　　治疗前(s)　　治疗后28 d(s)假手术组　29.94±9.67　30.60±8.85模型组　102.95±6.351)　108.39±3.30阳性对照组　105.26±5.361)　65.73±6.112) 4)黑逍遥散低剂量组　102.25±6.421)　70.26±5.392) 3) 4)黑逍遥散中剂量组　101.42±4.811)　68.78±6.272) 4)黑逍遥散高剂量组　103.75±6.471)　58.21±5.912) 3) 4)

2.2不同时期各组大鼠穿越平台次数比较治疗前，各组大鼠与假手术组比较，穿越平台的次数显著减少(P＜0.05)。治疗后，与阳性对照组比较，黑逍遥散低剂量组穿越平台的次数显著减少(P＜0.05) ;中剂量组穿越平台的次数与之相当(P＞0.05) ;高剂量组穿越平台的次数显著增加(P＜0.05) ;自身比较，治疗后与治疗前比较，假手术组和模型组大鼠穿越平台的次数相差不大，差异无显著性意义(P＞0.05)，阳性对照组、黑逍遥散各剂量组大鼠穿越平台的次数均有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2　不同时期各组大鼠穿越平台的次数(±s，n=14)

组别　　治疗前(次)　　治疗后28 d(次)假手术组　2.78±1.20　2.49±0.88模型组　0.71±0.761)　0.57±0.53阳性对照组　0.73±0.751)　2.18±0.752) 4)黑逍遥散低剂量组　0.76±0.351)　2.28±0.652) 3) 4)黑逍遥散中剂量组　0.75±0.511)　2.46±1.312) 4)黑逍遥散高剂量组　0.77±0.341)　2.69±0.732) 3) 4)

2.3黑逍遥散对AD大鼠脑组织匀浆AchE、ChAT和MAO活性的影响与假手术组比较，模型组大鼠脑匀浆中的AchE含量显著增高，ChAT活性显著降低(P＜0.05) ;与模型组比较，各治疗组大鼠脑匀浆中的AchE活性显著减弱，ChAT活性显著增强(P＜0.05) ;与阳性对照组比较，黑逍遥散低剂量组AchE活性增强，ChAT活性减弱(P＜0.05) ;中剂量组AchE、ChAT活性与之相当，无显著性差异(P＞0.05) ;黑逍遥散高剂量组AchE活性减弱，ChAT活性增强(P＜0.05) ;黑逍遥散各剂量组AchE活性逐渐减弱，剂量依赖性降低，相关系数r=－0.99，ChAT活性逐渐增强，剂量依赖性升高，相关系数r=0.95，见表3。

表3　黑逍遥散对AD大鼠脑组织匀浆AchE、ChAT和MAO活性的影响(±s，n=14)

组别　AchE (U/L) ChAT (ng/ml) MAO (ng/ml)假手术组　31.43±3.21　 17.36±1.10　 8.78±0.13模型组　55.12±3.161)　9.23±1.781)　3.27±0.171)阳性对照组　42.60±3.102)　14.38±1.672)　9.39±0.142)黑逍遥散低剂量组　48.93±3.022) 3)　12.86±1.592) 3)　11.25±0.142) 3)黑逍遥散中剂量组　42.72±3.092)　13.81±1.112)　9.48±0.152)黑逍遥散高剂量组　5.41±3.132) 3)　15.94±1.202) 3)　8.94±1.612)

2.4黑逍遥散对AD大鼠脑组织AD大鼠海马病理损伤和超微结构的影响假手术组大鼠脑组织神经元细胞结构清晰，排列密集，极少量胶质细胞;模型组神经元细胞结构模糊，锥体细胞排列紊乱，胶质细胞增生，有些部位神经元细胞减少;阳性对照组大多数神经元细胞结构清晰，排列较整齐，细胞数目减少，胶质细胞增生;黑逍遥散低剂量组神经元细胞结构较清晰，排列欠整齐，细胞数目减少，胶质细胞增生;黑逍遥散中剂量组神经元细胞结构较清晰，排列欠整齐，细胞数目减少，胶质细胞轻度增生;黑逍遥散高剂量组大多数神经元细胞结构清晰，排列较整齐，细胞数目轻度减少，胶质细胞少量增生。见图1。

图1　海马HE染色图片(×10)

图2　神经元透射电镜图片

如图2所示，电镜下假手术组海马神经元分布正常，见核膜平整光滑，核呈圆形或椭圆形，核周胞质细胞器结构清晰，见高尔基体，线粒体，粗面内质网，核糖体结构;模型组神经元细胞核异染色质增多，染色质边集，核周胞质电子密度降低，细胞器肿胀，神经元细胞胞质内较多脂褐素颗粒;阳性对照组大部分神经元细胞结构趋于正常，有髓神经纤维髓鞘结构基本正常，大部分脑血管结构正常，血管外周间隙肿胀也明显缓解，仅见少量神经元细胞核形态异常，胞质内细胞器肿胀，少量脂褐素颗粒;黑逍遥散低剂量组核形态异常的神经元细胞，胞质内见较多脂褐素颗粒;黑逍遥散中剂量组部分神经元细胞细胞核异形，核周胞质细胞器肿胀，胞质内电子密度降低，局部神经元细胞神经毡部肿胀，脑血管外周间隙扩张，电子密度降低;黑逍遥散高剂量组大部分神经元细胞结构正常，有正常髓神经纤维髓鞘结构，少量神经元细胞核形态异常。

3　讨论

胆碱能假说是AD发病的重要机制之一。有研究表明〔4，5〕，AD发病与多种中枢神经递质如AchE、5-HT及DA等兴奋性氨基酸等的异常有关，其中胆碱能神经系统功能缺陷尤为突出。AchE是体内重要的神经递质，在机体学习与记忆方面发挥着重要的作用。基底前脑胆碱能神经元-海马-皮层和它们之间的通路，是学习记忆功能的重要结构基础。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量受损或死亡，突触前AchE的合成ChAT的活性以及对胆碱的摄取能力都明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关〔6〕。本实验结果表明，黑逍遥散能改善Aβ25～35所致AD模型大鼠行为学功能，提高学习和记忆能力;并可降低AD大鼠脑组织AchE和MAO活性、升高ChAT活性;还可改善Aβ25～35所致AD模型大鼠AD大鼠海马病理损伤。由此可见，黑逍遥散可通过调节中枢胆碱能神经递质和单胺类神经递质作用起到改善学习记忆、保护AD模型大鼠的作用。

现代药理学研究表明，黑逍遥散组方中熟地黄、茯苓、当归中所含的有效成分藁本内酯、阿魏酸、白芍总甙、茯苓多糖均具有一定的抗衰老作用〔7～13〕。王晓琳等〔13〕总结中药复方治疗老年痴呆的用药规律，发现抗老年痴呆使用频率高的14味药材就包括熟地黄、白术、茯苓、当归和甘草，表明本方中所含中药具有抗衰老的药效物质基础。

中医一般认为本病病位在脑，发病以内因为主，与肝、肾、心等脏功能失调密切相关，证属本虚标实，气、血、瘀、痰郁结为患。所以治疗多以补肾填精为主，辅以理气化痰，活血化瘀之品。临床研究和动物实验都表明补肾活血法和补肾健脾等治疗方法都能够有效改善AD症状〔14～16〕。笔者通过文献回顾分析，结合现代医学研究，认为AD的发生也与肝密切相关，治疗AD也应该重视从肝论治。黑逍遥散为其典型代表方逍遥散基础上再加一味熟地，更兼顾了肝肾同补，结合前期进行的相关药效学、作用机制的研究，结果表明黑逍遥具有显著改善AD模型大鼠学习记忆能力，增强大鼠认知、判断能力，这与其调节大鼠脑内相关神经递质的作用有着密切关系。

4　参考文献

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〔2015-01-22修回〕

(编辑李相军)

基金项目:国家自然科学基金项目(No．81060284)

〔中图分类号〕R749