电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马组织脑源性神经营养因子和神经营养素受体p75表达的影响

李晓洁，林如辉，陶静，赵从快，俞坤强，李春燕，彭洪卫，陈立典

电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马组织脑源性神经营养因子和神经营养素受体p75表达的影响

李晓洁1，林如辉2，陶静1，赵从快1，俞坤强1，李春燕1，彭洪卫1，陈立典3

[摘要]目的探讨电针治疗脑卒中后认知障碍的可能机制。方法45只Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为假手术组(n=15)、模型组(n=15)和电针组(n=15)。模型组、电针组用线栓法制备左侧局灶性脑缺血1.5 h再灌注模型。电针组电针神庭、百会穴7 d。采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力；Longa评分法观察大鼠神经功能缺损情况；HE染色观察大鼠海马神经元形态结构变化；免疫印迹法检测大鼠缺血侧海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素受体p75 (p75NTR)蛋白表达。结果与模型组相比，电针组逃避潜伏期缩短(P<0.05)，穿越平台次数显著增加(P<0.001)；神经功能缺损评分明显减少(P<0.01)；缺血侧海马区细胞损伤较轻，BDNF表达明显升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论电针能够改善脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力，其机制可能与上调大鼠海马组织中BDNF蛋白和下调p75NTR蛋白表达水平有关。

[关键词]脑缺血再灌注；学习记忆；电针；脑源性神经营养因子；神经营养素受体p75；大鼠

[本文著录格式]李晓洁，林如辉，陶静，等.电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马组织脑源性神经营养因子和神经营养素受体p75表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(9): 1020-1024.

CITED AS: Li XJ, Lin RH, Tao J, et al. Effects of electroacupuncture on learning and memory and expression of brain-derived neurotrophic factor and p75 neurotrophin receptor in rats with cerebral ischemia-reperfusion [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9):1020-1024.

认知功能障碍是脑卒中后常见的功能障碍[1-2]，不仅严重影响感觉、运动等其他功能康复，而且还会严重影响患者的日常生活能力和生活质量[3-4]。电针神庭、百会穴能在一定程度上改善脑卒中后认知功能障碍，但机制尚未完全阐明[5-7]。有研究指出，脑缺血发生时，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)与神经营养素受体p75(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)结合，激活c-Jun N-末端激酶(JNK)通路，从而诱导细胞凋亡[8]，影响认知功能。本研究观察电针神庭、百会穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力、海马神经元形态结构及海马组织中BDNF和p75NTR蛋白表达的影响，探讨电针治疗脑卒中后认知障碍的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

45只健康成年SPF级Sprague-Dawley大鼠，体质量(280±20) g，由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(闽)2005-004。大鼠分笼饲养，每笼5只。适应性喂养1周后，用随机数字表法将大鼠编号，分为假手术组(n=15)、模型组(n=15)和电针组(n=15)。

1.2主要实验试剂及仪器

线栓：广州佳灵生物技术有限公司。BDNF一抗：ABCAM公司。p75NTR一抗：Cell Signaling Technology公司。β-actin一抗、辣根过氧化物酶二抗：全式金公司。封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液：碧云天公司。

华佗牌电针治疗仪：苏州医疗用品厂有限公司。Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所。Image-lab图像分析系统：BIO-RAD公司。

1.3动物模型制备

在室温22℃下，大鼠称重，参考Longa等方法，行左侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[9]。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，常规去毛消毒，正中切开颈部皮肤，暴露颈总动脉，向上分离出颈内动脉和颈外动脉主干；在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉。用动脉夹夹闭颈内动脉，然后在颈总动脉结扎处远端约3 mm处剪一小口，将备好的线栓从切口导入。撤去颈内动脉血管夹，经颈内动脉缓慢推入线栓至大脑前动脉近端，约插入18～22 mm。固定线栓，缝合伤口。1.5 h后回抽线栓至颈总动脉分叉处。试验过程和动物苏醒期间注意保暖。

假手术组只分离动脉，不结扎、插线。

动物苏醒后观察其体态及行为，不合格的动物剔除。

1.4干预方法

电针组参考《实验针灸学》[10]取大鼠神庭和百会穴，应用华佗牌SDZ-V电针仪，针具采用无磁的金合银针，电流1～3 mA，以针体轻轻抖动为度，疏密波，频率2/10 Hz。造模后第2天开始，每次30 min，每天1次，共7 d。

假手术组、模型组置于普通笼中饲养，只给予同等条件抓取，不给予任何治疗。

1.5Morris水迷宫

Morris水迷宫为直径200 cm、高50 cm的圆形水池，水深30 cm，水温(25±2)℃；圆形逃逸平台直径6 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。室温22℃，屋顶和四壁表面光滑整洁，照明设备四周对称。各组造模后第3天开始检测。主要包括定位航行试验和空间探索试验。

定位航行试验历时4 d。大鼠自由游泳2 min以适应环境和人的抓握等相关操作。分别从水池4个象限将大鼠面向池壁放入水中，测其在90 s内找到平台所需的时间(逃避潜伏期)，由计算机记录各种参数。如果大鼠90 s内未找到平台，将其牵引到平台，停留10 s，潜伏期记为90 s。

在造模后第7天撤除平台，记录大鼠在90 s内穿过原平台所在位置的次数。

1.6神经功能缺损评分

采用Longa评分法[9]：0分，无神经功能缺损；1分，提尾时右前肢内收，不能完全伸展；2分，自发行走时向右侧转圈；3分，行走时身体向右侧倾倒；4分，不能自发行走，有意识丧失。得分1～3分者为造模成功；不合格的动物剔除。于造模后7 d再次评分。

1.7取材及检测

1.7.1HE染色

麻醉下开胸，生理盐水200 ml经左心室快速冲洗，4%多聚甲醛(pH=7.4) 200 ml灌流固定。取脑后置入4%多聚甲醛内4℃固定24～48 h。定位海马区，常规脱水，石蜡包埋，冠状切片，片厚约5 μm。二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，苏木精和伊红染色，光镜下观察组织病理学变化。

1.7.2蛋白免疫印迹法

取缺血侧海马组织置液氮罐中速冻，-80℃冰箱保存。取大鼠海马组织100 mg，加入裂解液1 ml和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF 10 μl，研磨均匀后静置30 min，取上清；4℃14 000 r/min离心5 min，吸取上清，BCA测定蛋白浓度。待样品蛋白变性后，10% SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜，封闭2 h后，分别加BDNF一抗(1∶2000)、p75NTR一抗(1∶750)、β-actin一抗(1∶5000)孵育，4℃过夜；用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)室温孵育1 h。将PVDF膜放于图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜1 min，Image-lab图像分析系统分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对灰度。

1.8统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。水迷宫数据采用重复测量方差分析。神经功能缺损评分不满足正态性，采用Mann-Whitney U检验。免疫印迹法数据满足正态性，采用ANOVA分析。数据均以(xˉ±s)表示，显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1Morris水迷宫

模型组造模后逃避潜伏期时间比假手术组显著延长(P<0.001)，电针组逃避潜伏期时间比模型组缩短(P<0.05)。见表1。与假手术组相比，模型组穿越平台次数显著减少(P<0.001)；与模型组相比，电针组穿越平台次数显著增加(P<0.001)。见表2。

表1　各组定位航行实验逃避潜伏期比较(s)

表2　各组大鼠空间探索实验穿越平台次数比较

2.2神经功能缺损评分

假手术组无神经功能缺损症状。造模后第1天模型组及电针组均出现神经功能缺损，两组间神经功能缺损评分无显著性差异(P>0.05)；造模后第7天，电针组神经功能缺损评分明显低于模型组(P<0.01)。见表3。

表3　各组神经功能缺损评分比较

2.3HE染色

模型组海马CA1、CA3区神经细胞稀少、排列疏松；残存神经元固缩破裂，存在空泡样变。电针组海马CA1、CA3区损伤较模型组轻，结构较完整。假手术组未见病理改变(图1)。

2.4免疫印迹法

与假手术组相比，模型组缺血侧海马组织中BDNF、p75NTR蛋白表达水平显著升高(P<0.001)；与模型组相比，电针组大鼠缺血侧海马组织中BDNF蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见表4。

表4　各组BDNF、p75NTR蛋白表达比较

图1　各组大鼠海马CA1、CA3区神经元(HE染色，400×)

3　讨论

认知功能障碍是脑卒中后常见的功能障碍。有研究指出，由于不同的卒中亚型和诊断标准，脑卒中患者17%～92%在脑卒中后3个月存在轻度认知障碍[11]。

临床研究表明，电针在一定程度上能改善脑卒中后认知障碍[12-14]。神庭为督脉、足阳明、太阳之会，百会为督脉、足太阳之会。神庭、百会穴皆属于督脉，两穴合用常起到开窍醒神的作用。

本研究显示，电针能改善脑缺血再灌注大鼠神经行为功能；HE染色观察缺血侧海马组织中神经细胞的溶解减少。这与前期研究结果[5-7,15]相一致，表明电针可以改善脑卒中后认知功能障碍。

BDNF是神经营养因子家族重要成员之一[16-17]，在脑中分布广泛，位于皮质、海马、基底节等区域。BDNF是由Barde等于1982年首次从猪脑中分离纯化出的具有促进神经生长活性的一种蛋白质[18-19]。有研究表明，BDNF在脑缺血损伤中，对维持神经元功能及抑制凋亡起着重要作用[20-21]。

p75NTR是肿瘤坏死因子受体家族中的一员[22-23]，能与神经生长因子、BDNF等诸多神经营养因子以低亲和力结合[24-25]。有研究表明，脑缺血损伤时，BDNF 与p75NTR结合，激活JNK通路，引发级联反应，诱导神经元凋亡[8]。本研究表明，电针可以明显下调脑缺血再灌注大鼠海马组织中p75NTR蛋白水平，从而减少BDNF与p75NTR的结合，进而可能阻断下游JNK通路的激活，从而抑制细胞凋亡。这可能是电针改善脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的机制之一。

综上所述，电针能改善局灶性脑缺血再灌注大鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与下调大鼠海马组织中p75NTR蛋白水平，从而减少BDNF与其受体p75NTR的结合有关。然而，由于脑卒中后认知功能障碍机制的复杂特性，以及电针作用的多靶点特性，其确切机制还需要进一步深入研究。

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·基础研究·

作者单位：1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州市350122；3.福建中医药大学，福建福州市350122。作者简介：李晓洁(1989-)，女，汉族，江苏无锡市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复与认知科学研究。通讯作者：陈立典(1963-)，男，汉族，福建政和县人，博士，教授，主要研究方向：神经康复与认知科学研究。E-mail: cld@fjtcm.edu.cn。

Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory and Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor and p75 Neurotrophin Receptor in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

LI Xiao-jie1, LIN Ru-hui2, TAO Jing1, ZHAO Cong-kuai1, YU Kun-qiang1, LI Chun-yan1, PENG Hong-wei1, CHEN Li-dian3
1. Rehabilitation Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 2. Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China

Abstract:Objective To observe the effects of electroacupuncture on learning and memory, and discuss the therapeutic mechanism. Methods 45 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=15), model group (n=15) and electroacupuncture group (n= 15). The latter 2 groups were modeled with middle cerebral artery occlusion for 1.5 h and reperfusion. The rats of electroacupuncture group received electroacupuncture at Shenting (DU24) and Baihui (DU20) for 7 days. Learning and memory ability was tested with Morris water maze. Neurologic impairment was assessed with Longa's score. Their hippocampus were observed under HE staining and the level of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and p75 neurotrophin receptor (p75NTR) protein were determined with Western blotting. Results Compared with the model group, the latency of water maze decreased and the times crossing the platform increased in electroacupuncture group (P<0.05), while the Longa's score significantly reduced (P<0.05), and the lesion of nerve cells were alleviated, with the decrease of p75NTR and increase of BDNF in the ischemic hippocampus (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory of cerebral ischemia-reperfusion rats, which may relate with up-regulating BDNF and down-regulating p75NTR in hippocampus.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; learning and memory; electroacupuncture; brain-derived neurotrophic factor; p75 neurotrophin receptor; rats

(收稿日期：2015-07-23修回日期：2015-08-18)

基金项目：福建省康复技术协同创新中心资助项目(No.X2012004－协同)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.008

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)09-1020-05