电刺激小脑顶核对脑缺血再灌注后大鼠脑组织损伤的影响及其机制

何兰英，罗勇，王健，董为伟

电刺激小脑顶核对脑缺血再灌注后大鼠脑组织损伤的影响及其机制

何兰英1，罗勇2,3，王健1，董为伟2,3

[摘要]目的探讨电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑保护作用的机制。方法Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组(NC组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注后小脑顶核刺激组(FNS组)、毁损小脑顶核组(FNL组)，后3组根据再灌注时间分为7 d和14 d两个亚组，每个亚组6只。大脑中动脉线栓法制作缺血再灌注模型。相应时间点采用Western blotting检测脑梗死周围组织核因子-κB (NF-κB) P50蛋白表达，逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Bcl-xL mRNA表达，同时检测各组脑梗死体积。结果与I/R组比较，FNS组NF-κB P50蛋白表达各时间点均增高(P<0.05)，TNF-α mRNA表达明显降低(P< 0.01)，Bcl-xL mRNA表达升高(P<0.05)，梗死面积明显减少(P<0.01)。与I/R组比较，FNL组上述指标均无显著性差异(P>0.05)。结论FNS可有效提高脑缺血再灌注后NF-κB P50蛋白、Bcl-xL mRNA表达，抑制下游炎症因子TNF-α mRNA的表达，减小脑梗死体积，可能是FNS发挥中枢神经保护的机制之一。

[关键词]脑缺血再灌注损伤；电刺激；小脑顶核；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；Bcl-xL；大鼠

[本文著录格式]何兰英，罗勇，王健，等.电刺激小脑顶核对脑缺血再灌注后大鼠脑组织损伤的影响及其机制[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(9): 1012-1015.

CITED AS: He LY, Luo Y, Wang J, et al. Effect of electrical stimulation to cerebellar fastigial nucleus on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1012-1015.

缺血性脑血管病是引起人类死亡的第二大疾病，也是导致功能残疾的最常见疾病。脑缺血再灌注后可引起一系列反应，导致神经细胞损伤和死亡，包括一氧化氮合成，兴奋性氨基酸、炎症介质、氧自由基生成，线粒体损伤，细胞程序性死亡以及胶质细胞激活[1-3]。某些治疗可以增加神经细胞对缺血的耐受性，或减轻再灌注损伤，延长治疗时间窗，提高再灌注损伤治疗的有效性。目前，针对上述机制研发了多种神经保护剂，但这些神经保护剂用于临床试验时，大多因无效或不良反应而被提前终止。

近年研究证明，电刺激小脑顶核(fastigial nucleus stimulation, FNS)对中枢神经具有广泛的保护作用，能抑制炎症因子的产生，抑制神经细胞凋亡，促进神经再生，促进神经结构和功能重建等[4-7]。本研究探讨FNS神经保护作用的机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂和设备

兔抗鼠核因子-κB (factor-kappa B, NF-κB) P50多克隆抗体(SC-114)、多克隆兔抗鼠内参β-actin抗体(SC-130657)：SANTA CRUZ公司。蛋白Marker：Fermentas公司。PVDF膜：美国ROCHE公司。总RNA提取试剂盒：上海华舜生物工程有限公司。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒：碧云天生物技术研究所。RT-PCR试剂盒：大连宝生物。Gel Doc 2000凝胶成像仪、PCR仪：Bio-Rad公司。高速冷冻离心机：BECKMAN公司。紫外分光光度仪：GENEQUANT公司。

1.2实验动物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量250～ 300 g，重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(渝)2007-0001。每天给予充足的食物和水，室温22℃左右。所有实验操作程序严格遵照实验动物管理和保护的条款执行。

大鼠随机分为正常对照组(NC组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注后小脑顶核刺激组(FNS组)，缺血再灌注后毁损小脑顶核组(FNL组)，后3组根据再灌注时间分为7 d和14 d两个亚组，每个亚组6只大鼠。NC组不给予任何处理；I/R组夹闭右侧大脑中动脉2 h后再灌注；FNL组为预先毁损小脑顶核5 d后再行缺血再灌注，随后行FNS治疗；FNS组为在局灶脑缺血再灌注后分别给予FNS。

术中出血较多、呼吸困难、取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除，并补足相应例数。

动物苏醒后参考Longa等的评分法评分[8]，2分或以上者入选。

1.3FNS

参照Nakai等的方法[9]，将大鼠固定在立体定位仪上，根据大鼠脑立体定向图谱并结合鼠的大小，确定小脑顶核的位置：以前囟后缘为0点，正中线向后11.4～11.8 mm，旁开0.8～1.0 mm，深5.2～5.7 mm。3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉。在大鼠颅骨上钻1个孔，将同心圆电极插入右侧小脑顶核。刺激参数：电流强度50 μA，频率50 Hz，0.5 ms直角方波脉冲；持续刺激1 h。刺激过程中动物处于浅麻醉状态。

1.4小脑顶核毁损

定位两侧小脑顶核，用0.5 μl微量注射器分别将0.2 μl鹅膏氨酸(SIGMA公司)注入两侧小脑顶核，留针5 min缓慢拔出，缝合皮肤。5 d后行脑缺血再灌注造模。

1.5梗死体积测定

每组大鼠在再灌注后7 d、14 d，以3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉，迅速断头取脑。取出全脑，置4℃0.1 mol/L PBS液中，清除表面脑膜和血块。置于-20℃冰箱中30 min。沿视交叉冠状切片，连续7个，片厚约2 mm。1% 2,3,5-氧化三苯基甲氮唑(TTC)溶液中37℃水浴30 min。0.01 mmol/L PBS溶液冲洗3次，4%多聚甲醛浸泡6 h后观察脑组织颜色。正常脑组织呈均匀红色，缺血组织呈白色。采用生物医学图像分析系统检测脑梗死面积，根据脑切片梗死面积及切片间距离计算梗死体积。

梗死体积=∑[(S1+S2)/2×H]

其中，S1和S2为每一切片上下两面病灶面积，H为梗死层面厚度。

1.6Western blotting

取大鼠缺血灶周围脑组织50 mg，剪成碎片，冰浴中玻璃匀浆器匀浆；4℃1000 g离心10 min；弃上清液，沉淀物中加蛋白裂解液500 μl，冰面上裂解30 min，4℃14000 g离心10 min，取上清液，分装后-20℃保存。Bradford法蛋白定量。取样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS- PAGE蛋白上样缓冲液至终浓度为1×。8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法至PVDF膜，室温下封闭液封闭1 h。分别加入1∶500多克隆兔抗鼠P50、内参β-actin多克隆兔抗鼠一抗，4℃孵育过夜。用相应的抗鼠二抗(1∶750)室温孵育2 h，化学发光法显色，凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，以其与β-actin比值作为代表其表达水平。

1.7RT-PCR

取大鼠缺血灶周围脑组织50 mg，按试剂盒说明进行总RNA提取，RT-PCR试剂盒说明进行TNF-a和Bcl-xL mRNA表达水平的测定。引物设计：

β-actin：上游5'-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC- 3'；下游5'- GCC AGG ATA GAG CCA CCA AT-3'。

TNF-α：上游5'-GTC AGC CGA TTT GCC ATT TCA- 3'；下游5'- ACA CGC CAG TCG CTT CAC AGA-3'。

Bcl-xL：上游5'-GTG CGT GGA AAG CGT AGA CA-3'；下游5'-CAG CCAAGG TGACCCATTAC-3'。

按照RT-PCR试剂盒说明进行TNF-a和Bcl-xL反应液体配置，按以下条件进行PCR反应。

TNF-α：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30个循环；72℃60 s，72℃5 min，4℃终止反应。

Bcl-xL：94℃2 min，94℃30 s，51℃30 s，30个循环；72℃60 s，72℃5 min，4℃终止反应。

β-actin：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30个循环；72℃60 s，72℃5 min。终止反应。

取PCR扩增产物5 μl，加入自行配制的6×上样缓冲液1.0 μl，1.5%琼脂糖凝胶上样；在1×TBE缓冲液中，100 V恒压电泳20 min；待产物充分电泳后，取出凝胶，Doc Gel 2000凝胶成像分析系统测定各条带光密度值，以与β-actin的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.8统计学分析

所有实验数据以(xˉ±s)表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，两两比较采用q检验。显著性水平α1=0.05，非常显著性水平α2=0.01。

2　结果

2.1NF-κB P50蛋白

NC组可见NF-κB P50蛋白少量表达。各时间点I/ R组NF-κB P50蛋白表达较NC组明显增加(P<0.01)。FNS组各时间点较I/R组NF-κB P50蛋白表达进一步增加(P<0.05)。FNL组各时间点NF-κB P50表达与I/R组相比无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2TNF-α mRNA

NC组TNF-α mRNA少量表达。各时间点I/R组TNF-α mRNA表达较NC组明显增加(P<0.01)。FNS组各时间点TNF-α mRNA表达较I/R组减少(P<0.05)。FNL组与I/R组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3Bcl-xL mRNA

NC组Bcl-xL mRNA仅有极少量表达。各时间点I/R组Bcl-xL mRNA表达较NC组明显增加(P<0.01)。FNS组表达较I/R组进一步增加(P<0.05)。各时间点FNL组与I/R组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1　各组大脑NF-кB P50蛋白，TNF-a mRNA和Bcl-xL mRNA表达

2.4梗死体积

NC组脑组织呈均匀红色，无白色梗死区；I/R组、FNS组右侧脑组织均可见大脑中动脉供血区呈白色梗死灶，左侧脑组织呈均匀红色。FNS组较I/R组显著减少(P<0.001)，FNL组与I/R组无显著性差异(P> 0.05)。见表2。

表2　各组大脑梗死体积比较(mm3)

3　讨论

正常情况下，NF-κB与抑制分子IκBα非共价结合成三聚体复合物，以无活性的形式存在胞浆内，无法进入细胞核发挥作用。脑缺血及再灌注后，IκBα磷酸化、泛素化，最终降解，释放游离NF-κB向细胞核内移位，与相应的κB位点结合[10-14]，迅速诱导靶基因转录。

NF-κB对神经细胞起保护还是损伤作用，目前还不十分清楚。伤害性刺激可引NF-κB活化，从而调控其下游基因的表达[15]。在大鼠脑缺血再灌注后30 min 或1 h时，NF-κB各亚基表达明显升高；通过抑制NF-κB活化可减少TNF-α诱导的细胞死亡，从而提出抑制NF-κB活化可能对神经细胞有保护作用。

目前，NF-κB在中枢神经系统的保护作用也已被广泛研究。NF-κB某亚基在中枢神经系统疾病中调控神经细胞存活，可能是由于激活Bcl-x、Bcl-2等表达[16]，并提出Bcl-x、Bcl-2的表达可能与NF-κB二聚体c-Rel/P50的活化有关。随后研究发现，脑缺血后抑制c-Rel/P50的表达，可使Bcl-x的表达减少[17-20]。

Bcl-xL是Bcl-2家族的重要成员，是一类具有抗凋亡作用的蛋白，在维持细胞生存中起关键作用。Li等研究显示，脑缺血后NF-κB的保护作用可能和NF-κB P50活化有关，敲除NF-κB P50后，神经细胞损伤较正常组明显加重[21]。

本研究与既往研究均证实，正常脑组织有极少量NF-кB P50蛋白、Bcl-xL和TNF-α mRNA表达；脑缺血再灌注后可诱导NF-κB P50以及下游因子Bcl-xL和TNF-α mRA表达。本研究发现，脑缺血再灌注后予FNS治疗可以显著增加NF-κB P50表达，同时伴TNF-α表达减少。Bcl-xL启动子中含有2个κB位点序列[22]。本研究显示，FNS在增加NF-κB P50表达的同时，Bcl-xL的表达也相应增加，而FNL组NF-κB P50、Bcl-xL和TNF-α mRA的表达均无明显改变。

小脑电刺激仪采用仿生物电流，将电极置于枕后乳突进行刺激，通过对小脑顶核的刺激作用，发挥神经保护作用。FNS治疗可改善脑血管微循环，减轻炎症因子的释放，减轻神经损伤，减少缺血区神经元的坏死凋亡，减轻脑梗死体积，从而起到神经保护作用，促进神经功能恢复，部分改善缺血再灌注损害[23-25]，已广泛应用于临床。本研究表明，FNS可通过增加P50生成，而抑制下游炎症因子TNF-α表达，增加抗调亡因子Bcl-xL的表达，减轻脑梗死体积，这可能是其神经保护机制之一。

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·基础研究·

作者单位：1.成都市第二人民医院神经内科，四川成都市610017；2.重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市400016；3.重庆市神经病学重点实验室，重庆市400016。作者简介：何兰英(1979-)，女，汉族，四川成都市人，博士，副主任医师，主要研究方向：缺血性脑血管病损伤及其保护机制。通讯作者：罗勇(1965-)，男，汉族，四川达州市人，研究员，博士生导师。E-mail: luoyong1998@163.com。

Effect of Electrical Stimulation to Cerebellar Fastigial Nucleus on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

HE Lan-ying1, LUO Yong2,3, WANG Jian1, DONG Wei-wei2,3
1. Department of Neurology, The Second People's Hospital of Chengdu City, Chengdu, Sichuan 610017; 2. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China

Abstract:Objective To investigate the effect of electrical stimulation to cerebellar fastigial nucleus on expression of nuclear factor-kappa B (NF-кB) P50, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and Bcl-xL mRNA in rats brain after cerebral ischemia-reperfusion. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (NC group), cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), fastigial nucleus stimulation (FNS) group, and fastigial nucleus lesion (FNL) group. A focal cerebral ischemia-reperfusion model was established with middle cerebral artery occlusion (MCAO). 7 and 14 days after operation, the infarct volume was measured, and the protein of NF-кB P50 in rats brain was detected with Western blotting; the expression of TNF-α and Bcl-xL mRNA was detected with RT-PCR. Results Compared with I/R group, the expression of NF-кB P50 protein increased in FNS group (P<0.05), with the decrease of expression of TNF-α mRNA (P<0.01) and increase of Bcl-xL mRNA (P<0.05), while the infarct size decreased (P<0.01). There was no significant difference between FNL group and I/R group for all the measurements (P>0.05). Conclusion FNS could induce the expression of P50 protein and Bcl-xL mRNA, and inhibit the expression of TNF-α mRNA, and reduce infarct size, which may associated with the neuroprotection of central nervous system from injury.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; electrical stimulation; cerebellar fastigial nucleus; focal factor-kappa B; tumor necrosis factor-α; Bcl-xL; rats

(收稿日期：2015-03-28修回日期：2015-06-12)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.006

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)09-1012-04