小儿双金清热口服液抗RSV病毒作用机制研究

崔清华，吕旭潇，何　军，侯　林，郝信东，田景振

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355;2.山东润华药业有限公司，山东济南250200)

小儿双金清热口服液抗RSV病毒作用机制研究

崔清华1，吕旭潇1，何军2，侯林1，郝信东2，田景振1

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355;2.山东润华药业有限公司，山东济南250200)

摘要:目的研究小儿双金清热口服液对体内抗呼吸道合胞病毒的作用机制。方法建立小鼠呼吸道合胞病毒感染模型，检测小儿双金清热口服液对呼吸道合胞病毒感染小鼠的体重，肺指数以及肺病理变化等方面的影响。结果小儿双金清热口服液能明显增加呼吸道合胞病毒感染小鼠的体重，增加T细胞增殖转化率以及自然杀伤细胞的杀伤活性(P＜0.01)。结论小儿双金可以改善细胞免疫功能，减少病毒对机体的免疫损伤。

关键词:呼吸道合胞病毒;抗病毒; T淋巴细胞增值转化;自然杀伤细胞

小儿双金清热口服液为全国独家品种，主要用于小儿外感及发热，疗效显著，受到医生和患儿家长的信赖。本方主要成分:金银花、蒲公英、大青叶、板蓝根、赤芍、柴胡、秦艽、荆芥、淡竹子、莱菔子、桔梗、苦杏仁、僵蚕、广藿香、石菖蒲、郁金［1］。呼吸道合胞病毒(RSV)属于副粘科RNA病毒，是引起婴幼儿肺炎、支气管炎［2］与成人哮喘急性发作的主要病因［3，4］。课题组在前期通过实验证明了小儿双金口服液具有抗RSV病毒的作用，拟通过本实验明确小儿双金抗RSV病毒的作用机制。

1　实验材料

1.1动物昆明种小鼠，体重(13±1) g，购自山东济宁鲁抗有限公司，动物合格证号: SCXK (鲁) 20130001。

1.2病毒RSV由山东省医学科学院微生物室提供。

1.3药物与主要试剂小儿双金清热口服液(以下简称双金，山东润华医药有限公司，批号: 140112) ;双黄连口服液(哈尔滨三精通泰制药有限公司，批号: 14012547) ;刀豆蛋白:以完全1640培养液配成0.5 mg·mL－1溶液，分装后于－20℃冻存;靶细胞:用YAc－1细胞株于实验前24 h传代1次，使用时用1640培养液调整细胞浓度至1×105·mL－1。

1.4主要仪器低温高速离心机(贺立氏台式低温离心机) ;倒置显微镜(Olympus公司) ;高压灭菌锅(济南德强仪器有限公司，MJ37600) ;纯水机(济南太平玛环保有限公司)。

2　方法与结果

2.1造模及分组小鼠随机分为6组，空白组、病毒组、双黄连对照组0.007 7 mL·g－1，小儿双金大剂量组0.027 mL·g－1(相当于临床用量的2倍)，中剂量组0.013 5 mL·g－1(相当于临床用量)，小剂量组0.006 8 mL·g－1(相当于临床用量的1/2 倍)，每组10只。乙醚轻度麻醉后，每鼠50 μL RSV病毒液滴鼻感染，空白组以等量生理盐水滴鼻。病毒接种完2 h后灌胃给药，每天1次，连续给药5 d，观察小鼠行为变化，末次给药后禁食不禁水，称重，眼眶取血，无菌环境下取脾制作脾细胞悬液，肺以生理盐水洗涤2～3次后用吸水纸吸干，称重，计算肺指数，放入4%多聚甲醛中留作病理切片。

肺指数=小鼠肺重/体重×100%

肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值－给药组肺指数均值)/病毒对照组肺指数均值×100% 2.2 T淋巴细胞增值转化［5］感染5天后的小鼠处死后，无菌取脾脏，滴加几滴PBS，用玻璃注射器的内芯研磨后过200目尼龙膜筛去连带的脂肪组织等，1 000 rpm，离心5 min，加0.87%的氯化铵破坏红细胞后，1 000 rpm，离心5 min，弃去液体后用1640调整细胞浓度为2×106，加入刀豆蛋白，使终浓度为含刀豆蛋白5 μg·mL－1，200 μL/孔加于96孔板中，设4复孔。5% CO2培养箱中孵育48 h后测MTT值。

2.3自然杀伤(NK)细胞杀伤活性测定［6］感染5天后的小鼠处死后，无菌取脾脏，滴加几滴PBS，用玻璃注射器的内芯研磨后过200目尼龙膜筛去连带的脂肪组织等，1 000 rpm，离心5 min，加0.87%的氯化铵破坏红细胞后，1 000 rpm，离心5 min，弃去液体后用1640调整细胞浓度为2×106，YAc－1细胞株于试验前24 h传代1次，使用时用1640培养液调整细胞浓度至1×105·mL－1，此时效应细胞与靶细胞比为20∶1，5% CO2培养箱中孵，24 h后测MTT。结果用统计软件SPSS 17.0进行数据统计。

NK细胞活性(%)=［l－(测试孔A值－效应细胞对照孔A值)/靶细胞对照孔A值］×100%

3　实验结果

3.1各组实验小鼠行为的观察正常对照组小鼠精神良好，行动敏捷，皮毛顺滑，进食饮水量正常，体重逐日增加。其余各组小鼠，感染后表现为体重减轻，厌食、行动迟缓、毛无光泽、蜷缩，双黄连组与小儿双金给药组中部分小鼠给药后能逐渐恢复正常，部分不能。

图1　96孔板点板示意图

3.2肺指数和肺指数抑制率感染病毒后，小鼠肺重增加，肺指数相应增加，因而肺指数可作为评价药物是否具有抗病毒作用的指标。各剂量对RSV所致小鼠肺指数的影响结果见表1。

表1　小儿双金对RSV感染小鼠肺指数的影响

结果显示，正常组动物肺指数明显低于病毒对照组，说明成功建立了呼吸道感染的模型。而用药各组的肺指数低于病毒对照组，说明药物组对已经感染呼吸道病毒的动物有一定的治疗作用。由上表可知，病毒对照组除了与小儿双金小剂量组无明显差异，与其余各组均有显著性差异(P＜0.01)，双黄连组与小儿双金大剂量组、中剂量组无显著性差异(P＞0.5)，说明小儿双金的大剂量组与中剂量组与双黄连比较，具有相同的抗呼吸道合胞病毒的作用。

3.3小儿双金对小鼠肺组织病理变化的影响结果见图2，显微镜下观察小鼠肺组织HE染色切片，正常组小鼠肺组织肺泡壁薄，管腔内无分泌物，无充血及炎性细胞浸润。病毒对照组肺泡壁增厚，充血严重并伴有大量的浆液性渗出，肺实变非常明显，炎性细胞浸润区呈片状分布。给药各组炎性细胞浸润明显减少，浆液性渗出及肺实变情况减轻，一定程度上减少了肺组织的病理损伤。

3.4T淋巴细胞增值转化结果见表2。由表2可以看出，病毒组与其余各组比较均有显著性差异，空白组与其余各组比较均有显著性差异，小儿双金大剂量与中剂量组与阳性药物双黄连组比较有显著差异，只有小剂量与双黄连组比较有差异，说明小儿双金在治疗呼吸道病毒感染的机体时用药量与T细胞增殖量没有剂量依赖关系，但在一定程度上各剂量组都可以增加T淋巴细胞的增值。病毒感染机体后，细胞免疫功能有所降低，病毒对照组T淋巴细胞增殖能力下降，与正常对照组比显著降低，各药物治疗组T淋巴细胞增殖能力得到了提高，差异显著。小儿双金可以改善细胞免疫功能，减少病毒对机体的免疫损伤。

图2　各组小鼠肺组织病理图

表2　T淋巴细胞增值转化

3.5 NK细胞杀伤活性测定结果结果见表3。由表3可以看出病毒对照组与其余各组的NK杀伤活性有显著性差异，说明病毒感染组的NK活性降低，各给药组的NK杀伤活性得到提高，而且除小儿双金小剂量外，小儿双金大剂量组、中剂量组与双黄连组比较没有显著差异(P＜0.01)，说明小儿双金在提高NK活性方面与双黄连功效相同。

表3　NK细胞杀伤活性测定

4　讨论

小儿双金能明显地延迟病毒感染后的体重下降，促进体重恢复，减轻其他临床症状，降低死亡率。刀豆蛋白可诱导T淋巴细胞发生增殖，淋巴细胞增殖的高低可以反映机体细胞免疫及体液免疫的水平。淋巴细胞增殖试验是检测机体免疫功能最常用的指标之一［7，8］。病毒对照组NK细胞活性明显下降，与正常对照组比显著降低，小儿双金各药物治疗组与病毒对照组比较，NK细胞活性得到了提高，差异显著。研究结果提示了小儿双金功效与其增强细胞免疫功能，促进T淋巴细胞增值，提高NK细胞活性，从而增强机体免疫功能发挥抗病毒作用。

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Study on mechanism of antiviral effects on RSV of Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid

CUI Qing-hua1，LV Xu-xiao1，HE Jun2，HOU Lin1，HAO Xin-dong2，TIAN Jing-zhen1
(1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250335，China; 2.Shandong Runhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250200，China)

Abstract:Objective To study the mechanism of Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid against respiratory syncytial virus (RSV) .Methods To establish the mouse model of RSV virus infection，detect Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid on body weight in mice infected with the RSV virus，and the effect of lung index and lung pathological changes etc.Results Xiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid could significantly increase the RSV virus infection weight in mice body and increase value added conversion rate and T cell killing activity of NK cell (P＜0.01) .ConclusionXiaoer Shuangjin Qingre Oral Liquid can improve the cellular immune function and reduce the damage of the body's immune virus.

Key words:RSV; Antiviral; Tlymphocyte proliferation and transformation; NK cell

通讯作者:田景振，男，教授，博士生导师，研究方向:中药新药、新剂型研究，Tel: 0531－89628597，E－mail: tianjingzhen@163.com

作者简介:崔清华，女，研究方向:中药制剂分析，E－mail: user753951@163.com

基金项目:山东省高等学校中医药抗病毒协同创新中心项目(No.xtcx2014c－02)

中图分类号:R285

文献标识码:A

文章编号:2095－5375(2015) 10－0568－003