六味地黄丸中马钱苷大鼠药代动力学研究

曾庆兰，崔向珍

(1.山东大学附属省立医院妇产科，山东济南250021;2.山东商业职业技术学院食品药品学院，山东济南250103)

六味地黄丸中马钱苷大鼠药代动力学研究

曾庆兰1，崔向珍2

(1.山东大学附属省立医院妇产科，山东济南250021;2.山东商业职业技术学院食品药品学院，山东济南250103)

摘要:目的建立液质联用法测定大鼠血浆中马钱苷浓度的方法，研究健康大鼠灌胃六味地黄丸后马钱苷的药代动力学特征。方法6只健康雄性Wistar大鼠，分别按10 g·kg－1灌胃给予六味地黄丸混悬液，按设定时间点采集血液样本，采用已建立液质联用法测定血浆中马钱苷浓度。采用DAS 2.0药代动力学软件计算药代动力学参数。结果马钱苷主要药代动力学参数分别为t1/2(4.398±1.633) h，Tmax(2.083±1.021) h，Cmax(369.314± 53.452) ng·mL－1，AUC0～24(2 275.174±553.825) ng·mL－1·h，AUC0～∞(2 343.478±601.313) ng·mL－1·h。结论本研究建立的测定大鼠血浆中马钱苷浓度的液质联用法灵敏度高，重现性好，适于大鼠体内马钱苷血浓度测定及药代动力学研究。大鼠灌胃给予六味地黄丸后，马钱苷药时曲线呈双峰。

关键词:六味地黄丸;马钱苷;药代动力学;液质联用

六味地黄丸由熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻6味中药组成，是滋阴补肾的传统中药［1］。实验证实，六味地黄丸具有较好的改善心血管系统、抗衰老、治疗肾阴虚及保护免疫系统等药理活性。六味地黄丸临床应用十分广泛，可用于内科、妇科、儿科及肿瘤等多个科别［2］。

已报道文献对六味地黄丸药理及药效研究较多。由于组方化学成分复杂，包括苷类、酚类、酸类及鞣质等，所以关于体内代谢过程的研究较少。研究六味地黄丸效应成分在体内的药代动力学特征，对其配伍机制研究及临床应用具有重要意义［3］。药典中以丹皮酚和马钱苷的含量作为质量控制的指标，同时结合文献研究结果［4］，本研究主要以马钱苷(结构式见图1)为检测指标进行六味地黄丸大鼠体内药代动力学研究。

1　材料及方法

1.1实验动物及饲养条件健康Wistar大鼠6只，雄性，体重为(300±20) g，购自山东大学实验动物中心，动物合格证号: SCXK(鲁) 20090001，在正常条件下饲养1周。

图1　马钱苷结构式

1.2药品与试剂六味地黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产，批号: 7073615) ;马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号: 111640－200503) ;岩白菜素(内标，中国药品生物制品检定所，批号: 111532－200202)。

甲醇(色谱纯，美国JT.Baker公司，批号: H02E73) ;乙酸乙酯(色谱纯，美国Burdick＆Jackson公司，批号: HCQG2H) ;甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号: T20060124)。

1.3主要仪器Agilent 1200－6410液相色谱－质谱联用仪(美国安捷伦科学技术公司) ; XW－80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司) ;梅特勒－托利多AX－205 DR电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.4实验方法

1.4.1动物给药与样本采集给药:大鼠于实验前12 h禁食不禁水，六味地黄丸粉末用0.4%羧甲基纤维素钠制成混悬液，按10 g·kg－1(马钱苷为14.4 mg·kg－1)剂量进行灌胃给药。

样品采集:灌胃给药前(0)和给药后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h颈静脉窦取静脉血约0.5 mL于含肝素的试管中，摇匀，充分抗凝，5 000 rpm离心5 min，取血浆，－20℃保存，备测。

1.4.2生物样本处理取血浆样品100 μL，加入10 μL内标溶液(100 ng·mL－1)，涡旋混匀，加入3.5 mL乙酸乙酯，涡旋萃取2 min。以5 000 rpm离心5 min，吸取上清液，40℃水浴氮气吹干，用100 μL流动相复溶，10 μL进样分析。

1.4.3样本分析方法色谱条件:色谱柱为Wondasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm) ;流动相:甲醇: 水(含0.02%甲酸) (28∶72，V/V)，在线脱气;流速0.7 mL·min－1;进样量10 μL;柱温30℃。

质谱条件:负离子模式，ESI离子源，干燥气(N2)流速9 L·min－1，干燥气温度为350℃，毛细管电压4 000 V，雾化压力50 psi，选择性离子监测(SIM)方式，监测离子对m/z 435.2(马钱苷)和m/z 327.1(内标)，碎片电压均为110 V。

1.5数据处理与统计血浆样本经处理后，采用已建立的HPLC－MS法检测大鼠血浆中马钱苷浓度，用DAS 2.0药代动力学软件计算大鼠灌胃给予六味地黄丸后马钱苷药代动力学参数。

2　结果

2.1方法学验证结果专属性:分别取大鼠空白血浆0.1 mL、含100 ng·mL－1马钱苷空白血浆溶液以及2号大鼠灌胃六味地黄丸混悬液10 g·kg－1后45 min血浆样品，按“1.4.2”项下方法处理后进样分析，考察分析方法的专一性，结果见图2。

图2　色谱图A.空白血浆; B.标准品加空白血浆; C.大鼠单次给药后45 min样本

结果表明，该分析条件下空白血浆中无干扰马钱苷和内标的基质，可用于检测大鼠血浆样本中马钱苷浓度。

标准曲线与定量下限:分别精密称取马钱苷10.02 mg及内标标准品10.06 mg，用甲醇溶解配制1.0 mg·mL－1马钱苷母液和0.1 mg·mL－1内标溶液。马钱苷母液用甲醇稀释得到浓度分别为10、1.0和0.1 μg·mL－1的储备液。取储备液适量置试管中，氮气吹干后加入100 μL空白血浆，分别配成浓度为5、10、50、100、250、500、750和1 000 ng·mL－1的马钱苷标准血浆样本，样本按“1.4.2”项下方法处理后进样分析(平行5样本)，线性回归方程为Y=0.017 1X+0.002 6，R2=0.995 7。马钱苷在5～1 000 ng·mL－1范围内线性关系良好，定量下限5ng·mL－1(S/N＞10)，RSD为11.8%，可以满足大鼠血浆中马钱苷测定要求。

绝对回收率:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)浓度的马钱苷质控血浆样本，按“1.4.2”项下方法处理后进行分析(平行5样本)，得到提取后马钱苷色谱峰面积A;用溶剂代替空白血浆配制低、中、高浓度样本，同法操作，得到马钱苷标准谱峰面积A0;以A/A0×100计算绝对回收率，结果低、中、高3个浓度绝对回收率均大于70% (RSD＜ 8%)，内标绝对回收率大于65% (RSD)可以满足血浆中马钱苷定量检测要求。

批内和批间精密度:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)浓度的马钱苷质控血浆样本，提取后进行分析(平行5样本)，连续3 d，每天测定1个分析批，计算批内和批间的准确度均在95%～110%之间，相对标准偏差均小于6% (见表1)，均符合生物样本中药物检测要求。

表1　准确度与精密度(x±s)

稳定性考察:配制低、中、高(10、100和750 ng·mL－1)浓度马钱苷质控血浆样本，－20℃条件下进行冻融1次、冻融2次、－20℃存放1 d和7 d的稳定性以及提取后放置10 h稳定性考察，提取后进行分析(平行5样本)。测定结果表明，马钱苷血浆样品在以上条件下放置后准确度均在95%～102%之间(见表2)，样本稳定性较好。

表2　马钱苷血浆中稳定性考察(n=5)

2.2大鼠药代动力学研究结果6只健康大鼠灌胃六味地黄丸后，血浆样本采用上述建立的分析方法测定。血浆中马钱苷浓度均值－时间曲线见图3。

图3　大鼠灌胃后马钱苷血浆浓度均值－时间曲线(n=6)

根据大鼠灌胃给予六味地黄丸混悬液后马钱苷血浆浓度－时间数据，采用DAS 2.0药代动力学软件计算马钱苷药动学参数，结果见表3，其中Cmax和Tmax为实测值。

3　讨论

文献报道马钱苷测定方法多为高效液相色谱法，

表3　大鼠灌胃六味地黄丸(10 g·kg－1)后马钱苷药动学参数(n=6)

其最低定量限较高［5，6］，无法满足较低浓度检测。为保证检测结果的准确性，本实验建立液质联用(HPLC－MS)方法测定大鼠血浆中马钱苷浓度，方法学验证结果表明灵敏度高，重现性好。血浆中马钱苷在5～1 000 ng·mL－1浓度范围内线性关系良好;最低定量限5 ng·mL－1;绝对回收率均大于75%;批内及批间精密度均小于15%;马钱苷血浆样本在－20℃冷冻及反复冻融条件下稳定，可用于大鼠体内马钱苷血浆浓度的测定及其药代动力学研究。

文献表明，单剂量给予马钱素单体后，t1/2(α) 为3.2 min; t1/2(β)为25.1 min［7］。六味地黄汤中马钱苷小鼠体内药代动力学参数为Tmax为42.4 min，t1/2(α)为17.4 min，t1/2(β)为35.75 min，马钱苷在小鼠体内为单室模型一级吸收，而单体马钱苷为二室模型一级吸收，组方中马钱苷消除变慢，可能是组方配伍成分对马钱苷药代动力学产生影响［8］。

本实验中大鼠灌胃给予六味地黄丸后，马钱苷药时曲线出现双峰现象。肝肠循环是药物呈双峰的主要原因，但大鼠无胆囊，肝肠循环可能不是马钱苷双峰的原因。由于六味地黄丸组方复杂，而中药组方配伍彼此影响各成分药动学参数的

研究已有报道［9，10］。因此，可能是六味地黄丸中其他成分通过影响体内药物代谢酶与马钱苷产生相互作用［11］，从而影响马钱苷在体内的代谢过程。

参考文献:

［1］李保院，姜宏，边瑞民，等.六味地黄丸的临床应用进展［J］.药学研究，2014，33(3) : 170－171.

［2］赵广文.六味地黄丸现代研究的文献分析［J］.现代中西医结合杂志，2006，15(24) : 3410－3411.

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［4］文红梅，过科家，杏文龙，等.六味地黄方在大鼠及家兔体内的吸收入血成分的研究［J］.南京中医药大学学报，2007，23(2) : 96－100.

［5］唐益华，肖凯华.RP－HPLC法测定浓缩六味地黄丸中马钱苷的含量［J］.中国药事，2007，21 (10) : 834 －835.

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［11］魏玉辉，秦红岩，段好刚，等.六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶P450活性的影响［J］.中国医院药学杂志，2008，28(19) : 1665－1669.

Study on the pharmacokinetic of loganin in Liuwei Dihuang Pills in rats

ZENG Qing-lan1，CUI Xiang-zhen2
(1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China;2.Institute of Food and Drug，Shandong Institute of Commerce and Technology，Jinan 250103，China)

Abstract:Objective To establish an HPLC－MS methods for the determination of loganin in rats plasma and to study the pharmacokinetic of loganin after administration of Liuwei Dihuang Pills.Methods 6 Wistar rats were administrated with Liuwei Dihuang Pills suspension (10 g·kg－1).The blood samples were collected as scheduled time and analyzed by HPLC－MS.The pharmacokinetic parameters of loganin were calculated by DAS 2.0 pharmacokinetic software.Results The main parameters of loganin in Liuwei Dihuang Pills were shown as follows: t1/2(4.398±1.633) h，Tmax(2.083± 1.021) h，Cmax(369.314±53.452) ng·mL－1，AUC0～24(2 275.174±553.825) ng·mL－1·h，AUC0～∞(2 343± 601.313) ng·mL－1·h.Conclusion The HPLC－MS method was sensitive and selective for determination of loganin in plasma.A bimodal phenomenon was observed in the plasma prole after administration of Liuwei Dihuang Pills.

Key words:Liuwei Dihuang Pills; Loganin; Pharmacokinetics; HPLC－MS

通讯作者:崔向珍，女，副教授，研究方向:生化药物与药物分析，Tel: 13864186415，E－mail: cxzjinan@163.com

作者简介:曾庆兰，女，主管护师，研究方向:老年病护理干预和相关药物分析，E－mail: xy@ sdcoal.gov.cn

中图分类号:R285.5

文献标识码:A

文章编号:2095－5375(2015) 10－0571－004