双向薄层色谱法分析混合糖组分

刘秀花, 崔孟岐, 王莉, 张淑红，宋兆齐,，梁峰

(1.商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘， 476000;2.商丘师范学院 生命科学学院，河南 商丘， 476000)

双向薄层色谱法分析混合糖组分

刘秀花1,2, 崔孟岐2, 王莉2, 张淑红1,2，宋兆齐2,1，梁峰1

(1.商丘师范学院 生物精炼河南省工程实验室，河南 商丘， 476000;2.商丘师范学院 生命科学学院，河南 商丘， 476000)

薄层色谱法分析糖类混合物的组分简便快速，但是并不能将甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖进行彻底分离.本文采用双向层析的方法分别以V乙腈∶V水=85∶15为第一向展层剂，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1为第二向展层剂优化层析.结果显示，得到了较好的分离效果，可以定性检测出糖类组分.对比国内外研究，此方法简单，因此双向薄层色谱法可以作为一种简单、准确、清晰、便利的方法定性检测糖类混合物的组分.

薄层色谱法；生物质；展层剂；糖类；

近年来，为应对国际能源供需矛盾，全球气候变化等挑战，越来越多的国家将发展生物质能作为替代化石能源、保障能源安全的重要战略措施，积极推进生物质能开发利用.随着国际石油市场供应紧张和价格上涨，发展生物燃料乙醇和生物柴油等生物液体燃料已成为替代石油燃料的重要方向.目前，以甘蔗、玉米和薯类作物为原料的燃料乙醇和以植物油脂为原料的生物柴油在欧洲已实现大规模应用.我国生物质能利用技术和装备处于起步阶段，仍未掌握关键技术而且生物柴油生产技术应用水平还不高，生物质能利用水平低，转化效率有待提高.

生物质利用的一个主要障碍是缺乏对植物细胞壁有效的预处理，以便碳水化合物可以随后被水解成糖来发酵成燃油或化学品[1].糖类是自然界存在数量最多的有机化合物，不仅是生物体的结构成分，也是生物体内的主要能源物质，跟植物体内的新陈代谢有密切联系，分离检测各种生物质降解液可溶性糖的种类，有助于对生物质转化为生物柴油的工艺优化研究.

对比国内外研究，糖类的分离一般采用高效液相色谱或是离子交换色谱，薄层层析，展开剂种类虽然很多，在多展层剂的薄层色谱测定中，虽然大多数糖能被一次性分离[2-6]，但是像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖这样的分解液中常有的糖类却总是因为Rf值相近而无法分离完全.因此,本实验通过对比多种展层剂的展层效果，运用双向层析，增加展距，提高了分离能力，从而得以分析出糖类混合物组分.

1 材料和方法

1.1 材料

薄层层析硅G型、乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，无水乙醇，乙腈，磷酸，苯胺，二苯胺，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七叶苷，L-鼠李糖，麦芽糖，α-乳糖均为分析纯级试剂，蒸馏水.

1.2 方法

1.2.1 标准糖液的配制

分别配制D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-蔗糖、七叶苷、L-鼠李糖，麦芽糖、α-乳糖等1%的乙醇溶液.选取D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖等5种溶液，配制0.25%的混合糖液A.选取上述10种溶液配制0.25%的混合糖液B，保存于4℃冰箱中待用.

1.2.2 展层剂的配制

按照展层剂的配方，将量取好的各种展层液混合在一起，置于层析缸中，温度控制在4～9 ℃左右.展层剂高度不超过1cm.让展开剂的蒸气充满层析缸，为防止边沿效应，饱和时间在0.5 h左右. 使用的展层剂如表1：

表1 糖的薄层色谱使用的展层剂体系

注:展层剂体系的试剂的比例均是体积比

1.2.3 薄层层析

选取20 cm×20 cm和10 cm×20 cm层析板，0.25%羧甲基纤维素钠水溶液作为黏合剂，取硅胶 4 g与12 mL的0.25%羧甲基纤维素钠水溶液混合研磨涂布制板，过程采用自然流动混合均匀法，水平静置自然风干. 使用前将薄层板置于105℃烘箱内活化30 min，置于干燥器中备用.

第一向展开，把配制好的展层剂1倒入层析缸中，放在4～9℃层析柜中进行饱和30 min，点好样层析，当溶剂前沿扩展到层析板上端约1～2 cm处时，取出板并晾干.第二向展开，待层析板晾干后，顺时针旋转90°，放在展层剂2进行第二步层析，当溶剂前沿扩展到距薄层板上端约1～2 cm处时，取出板并晾干.

1.2.4 显色

苯胺-二苯胺-磷酸显色剂：取50 mL丙酮置于烧杯中，依次加入5 mL 85%磷酸，1 mL苯胺和1 g二苯胺，磁力搅拌器加热，直至均匀无颗粒.将显色剂均匀喷洒板上， 85 ℃烘箱加热10 min左右显色.

2 结果与分析

2.1 单向层析对单糖分离的效果

本实验以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1为展层剂，以单向层析对D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖这5种单糖及其混合液进行分离，结果如下图1：

点样：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖，6.混合糖液1

Figure 1 developing solvent 2 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose , 6.solution 1图2 展层剂1对糖分离效果图谱(展层剂为V乙腈∶V水=85∶15)

点样：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖

Figure 2 developing solvent 1 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose .

从图1可以看出，在展层剂为：V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1进行分离的结果较为清晰，但是由于D-葡萄糖，L-阿拉伯糖的Rf值相近，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖层析结果显示重合在一条水平层析带上，并不能将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通过单向层析一次性彻底分离.这为薄层层析分析糖类混合物的组分带来不便，不能有效对各种糖类降解液、混合糖液进行组分分析优化研究.

为了将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通过薄层层析彻底分开，反复对比不同展层剂的分离效果，以V乙腈∶V水=85∶15为展层剂进行层析分离时，结果如图2.

从图2可以看出，在以V乙腈∶V水=85∶15为展层剂对D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖进行薄层层析分离时，可以将L-阿拉伯糖和D-葡萄糖分开，但是D-甘露糖和D-葡萄糖层析结果在水平方向有重合，因此，V乙腈∶V水=85∶15这种展层剂液不能将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖分离完全.

2.2 双向层析对单糖混合物分离的效果

从图1可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖因为Rf值太近在单向层析时，很难分开；从图2可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖虽然Rf值较为接近，但是仍然是可以通过特定展层剂层析分离开.这是由单向层析展距的局限性决定的，为了扩大展距，增强分离能力，需要以双向层析进行分离.

因此，为了薄层层析将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖这5种糖彻底分离，以V乙腈∶V水=85∶15为第一向展层剂，在展层结束后，顺时针旋转90°，又以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1为第二向展层剂，进行了双向层析，如图3.

从图3，可以看出，在以V乙腈：V水=85∶15为第一向展层剂，以V正丁醇：V乙酸乙酯：V水=7∶2∶1第二向展层剂双向层析时，展距扩大，增强了分离能力，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖得以彻底分离，从而达到了通过薄层层析对混合糖进行分离的效果，对于定性研究糖类混合物的组分有重大的意义，木糖因为层析的作用强，经过双向层析位于右上角，而半乳糖位于左下角，阿拉伯糖则能够与葡萄糖分开，略微靠右.

相对于国内之前的研究，双向层析将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖这5种单糖混合物彻底分开，得到了清晰、直观的层析结果，准确定性糖类混合物的组分.

2.3 双向层析对多种混合糖的分离效果

从图3可以看出，双向层析对单糖混合物分离结果比较清晰，由于具备较强的展开能力，双向层析可以将单糖的混合物进行分离，为了验证双向层析的实用性，本次试验共采用D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七叶苷，L-鼠李糖，麦芽糖，α-乳糖共10种糖，以V乙腈∶V水=85∶15为第一向展层剂，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展层剂双向层析，结果如图4.

如图4所示，以V乙腈∶V水=85∶15为第一向展层剂，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展层剂双向层析对10种糖类混合物进行分离，得到了较好的分离结果，相对于同类研究，双向层析是一种简单快速的层析方法，由于混合糖的组分复杂以及双向展开时薄层板的活度急剧下降等因素的影响，虽然可以成功分离开，但是未能获得清晰图像，后续还有待研究，继续进行优化.

3 结 论

前人研究表明，糖类混合物的组分鉴定一般采用高效液相色谱或是离子交换色谱，对技术要求较高、成本较高，但结果比较精确.薄层层析方法较简便，效果显现快，对较为粗略的测定是一种可选的方法.但有些糖类，比如像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖等在植物降解液常有的糖类却总是因为Rf值相近而无法完全分离.通过对比研究不同展层剂的分离效果，本实验最终确立以V乙腈∶V水=85∶15为第一向展层剂，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1为第二向展层剂的双向层析分离体系，同时以苯胺-二苯胺-磷酸为显色剂，效果比较理想，不仅将D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖组成的单糖混合物彻底分开.在增加多种糖的前提下，双向层析对D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七叶苷，L-鼠李糖，麦芽糖，α-乳糖这10种混合糖液进行分离，也得到了较好的分离效果.因此，双向层析可以选定为快速分析糖类混合物、植物水解液、微生物发酵液糖类组分的比较理想的分离体系.

本实验通过对多种糖类混合物的层析分离，为糖类混合物、植物水解液、微生物发酵液的层析分离鉴定奠定了基础，适合于大规模生物质降解液的快速定性鉴定.通过对比薄层色谱的展层剂对糖类的分离效果建立的双向层析，可作为一种快速、准确、便捷的测定方法快速分析糖类混合物组分.

[1] Ke J,LaskarDD,Gao D,Chen S. Advanced biorefinery in lower termite-effect of combined pretreatment during the chewing process [J]. Biotechnol Biofuels.2012 Mar 5;5(1):11. doi: 10.1186/1754-6834-5-11.

[2] 刘秀花，王莉，张淑红，等. 玉米芯降解液糖类成分薄层色谱法分析技术优化[J].商丘师范学院学报，2014,30(9):55-59.

[3] 张桂，李俊英，陈学武，等.薄层层析法测定纤维素材料水解液中混合糖的研究[J].理化检验-化学分册，2002,38(2)：81-82,84.

[4] 方琳.姚帅.崔亚君，等. 二维薄层色谱技术的研究进展[J].中成药，2014，36(3)：589-592.

[5] 张丽芝.单糖组成分析方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展，2013,41(1)：77-81.

[6] 姜晓满，田卫，张海霞，等，糖类物质的色谱分析[J].药物分析杂志，2006,26(8)：1181-1186.

[责任编辑：徐明忠]

·学术动态·

湖南师范大学博士生导师谢青季教授莅临我校讲学

2015年4月14日，应我校化学化工学院邀请，湖南师范大学“化学生物学及中药分析”教育部重点实验室主任、博士生导师谢青季教授来到我校，在文化路校区化学实验楼311室作了题为“金属标记的高敏安培生物分析”的学术报告.报告会由化学化工学院院长赵文献教授主持，化学化工学院部分师生聆听了报告.

谢青季教授首先从“核外电子运动”、“价电子转移的有效距离”和“金属标记型生物电化学分析”三个方面介绍了他的课题组开展相关科研工作的研究背景.随后，谢教授分别介绍了他的课题组在“纳米硫化镉标记的免疫和核酸适体高敏分析”、“基于金标银染和原电池置换反应的高敏免疫分析”以及“基于金标金染的高敏免疫分析”方向的最新研究成果，并与化学化工学院的教师们进行了深入的学术交流.

谢教授语言幽默、逻辑清晰，研究背景贴近生活，研究内容新颖前沿.本场精彩的学术报告让大家受益匪浅，博得了与会师生的阵阵掌声，尤其谢教授的课题组在阻抗分析式石英晶体微天平方面的创新性研究工作博得了在场师生的一致赞许.会后，谢教授与我校“生物分子识别与传感重点实验室”的科研人员就研究生培养及专业方向的一些学术问题进行了讨论和交流.

谢青季，博士，教授，湖南师范大学博士生导师、武汉大学分析化学专业校外博士生导师，化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室主任(湖南师范大学)、湖南省分析化学重点学科学术带头人.主持国家自然科学基金、国家重大基础研究计划前期研究专项、全国高校优秀青年教师教学科研奖励计划、教育部骨干教师资助计划和湖南省杰出青年基金等课题.已在Anal. Chem.、Adv. Funct. Mater.、J.Phys.Chem.B等学术期刊发表SCI收录论文90余篇.曾获首届全国高校优秀青年教师奖、中国化学会青年化学奖、省部级科技进步奖二等奖和湖南省教学成果奖一等奖等奖励，享受国务院政府特殊津贴.

Two-step thin layer chromatography for saccharides analysis of mixed saccharides liquid

LIU xiuhua1,2,CUI mengqi2, WANG li2, ZHANG Shuhong1,2，SONG Zhaoqi2,1， LIANG feng1

(1.Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China;2.Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

The thin layer chromatography(TLC)analysis of the mixed saccharides liquid composition effect is good, simple and rapid, but it doesn′t put the mannose, arabinose, galactose, xylose, glucose separately. This paper using the two step-TLC, the first step byVacetonitrile∶Vwater=85∶15，and the second step byVn-butanol∶Vethyl acetate∶VWater=7∶2∶1 as developing solvent for optimization of chromatography. Results show that using the above method to analyze saccharides mixture, got the good separation effect, can the qualitative detection of saccharides components, comparative research both at home and abroad, the use effect of the method is very simple and intuitive. Therefore, the two step thin layer chromatography(TLC)can be used as a simple, accurate, clear and convenient method of qualitative detection of saccharide mixture components.

TLC;biomass;developing solvent;saccharides;

2015-03-16

河南省重点科技攻关资助项目(132102310039,142102310044);河南省教育厅自然科学研究项目(13A180830)

刘秀花(1963-),女，河南新乡人，商丘师范学院教授，主要从事微生物资源、酶制剂、生物能源方面的研究.

O657.7

A

1672-3600(2015)06-0069-05