半导体聚合物纳米荧光探针的制备及生物应用研究进展

2015-03-02张佳楠常开文尹升燕吴长锋

发光学报 2015年7期

张佳楠，常开文，李琼，孙凯，尹升燕，吴长锋

(集成光电子学国家重点联合实验室吉林大学实验区吉林大学电子科学与工程学院，吉林长春 130012)

1 引言

荧光成像技术是生命医学领域的重要研究工具［1-2］。新型荧光成像技术可以在单分子水平上探测生物分子间的相互作用，也可以对亚细胞结构进行纳米分辨率的成像;另外还可用于监测基因表达、蛋白质运输和信号传导等细胞活动［3-7］。荧光探针的亮度和稳定性是决定荧光成像技术的灵敏度和检测限的重要因素。传统的有机染料分子做荧光标记时，其荧光亮度低和光稳定性差等缺点已经限制了现代荧光成像技术的进一步发展和应用。因此，开发新型荧光标记材料及技术成为化学、材料科学和生物医学等多学科交叉领域的研究热点。

在近十几年中，荧光纳米粒子在材料科学和生物医学等领域引起了广泛关注［8-9］。其中小尺寸的荧光纳米粒子在生物学应用中具有独特的优势，为此人们开发了各式各样的小尺寸量子点(Quantum dots，Qdots)，如无机半导体量子点、硅量子点、碳量子点和掺杂了染料的二氧化硅纳米粒子等［10-13］。经过表面包覆和生物功能化，无机量子点已经在生物医学成像研究中展示了重要应用［14-15］。以CdSe/ZnS为代表的无机半导体量子点由于量子尺寸效应而表现出独特的光学特性，而且可以通过调整量子点的尺寸获得各种发射波长。这种纳米标记探针具有吸收谱带宽、发射谱带窄、光谱对称、光化学性质稳定等性质。CdSe/ZnS量子点可以克服有机小分子染料光稳定性差的缺点，但是无机半导体材料一般含有重金属离子，其天然的毒性大大限制了这类量子点在生物活体成像和临床医学的实际应用。

有机半导体聚合物是一类因共轭电子而产生半导体性质的高分子材料，已被广泛应用于光电器件［16-17］。近年来，半导体聚合物在高灵敏的化学和生物传感器领域获得了广泛应用［18-20］。半导体聚合物具有光学吸收截面大、荧光量子效率高、辐射跃迁速率快等特性，这些优异的光学性质特别适合于开发生物应用方面的纳米荧光探针。目前人们已经开发了各种疏水聚合物、亲水聚合物和两亲性聚合物的荧光纳米粒子［21-25］。这些聚合物纳米粒子的荧光特性和胶体稳定性依赖于其自身的尺寸、组分、内部结构和表面特性等。

在众多种类的半导体聚合物纳米粒子中，尺寸大小和Qdots相当的半导体聚合物纳米粒子通常被称为聚合物量子点(Polymer dots，Pdots)［26］。这些小尺寸高亮度的聚合物量子点可以通过表面功能化与生物分子偶联，从而在生物医学应用中发挥重要作用［27-33］。本文概述了聚合物量子点的制备方法、荧光性质、表面功能化以及在生物应用等领域最近的进展。重点介绍聚合物量子点在细胞标记、体内成像、生物传感、单粒子示踪、药物输送和光动力学疗法等领域的应用。

图1 常见的半导体聚合物的化学结构Fig.1 Chemical structures of common semiconducting polymers

2 半导体聚合物量子点

通常情况下，在具有π-共轭结构的高分子中，电子云重叠使得π电子可以沿主链移动。这些π-共轭聚合物在本征态通常是宽带隙的半导体，因此可以称它们为半导体聚合物。这种聚合物的荧光特性可以用半导体能带理论来解释:在光激发下，电子从最高占据能带跃迁到最低空能带，被激发的电子和空穴形成了束缚态(激子);电子-空穴对的带间辐射复合导致辐射出光子。半导体聚合物的吸收波长由禁带宽度决定，因此通过改变聚合物的分子结构，人们可以获得可调吸收波长的半导体聚合物。目前开发出的半导体聚合物纳米粒子的发射波长可以遍及可见光谱［34］。

图1是近几年研究较多的几种半导体聚合物的化学结构。

2.1 半导体聚合物量子点的制备

一般来说，Pdots可以从低分子量的单体合成，也可以从高分子量的聚合物直接制备［35-37］。前者通常采用过渡金属催化偶联反应来获得，相比之下，后者可以直接使用市售的半导体聚合物，而且不需要特定的仪器设备和有机高分子合成方面的专业技术。目前，Pdots主要采用后一种方法制备。从高分子量的聚合物直接制备Pdots的典型方法包括微乳液法和再沉淀法。由于Pdots目前主要应用于生物学研究中，因此最后的溶剂通常选择水。在不同的制备方法中，半导体聚合物溶液的初始有机溶剂有一定的区别:在微乳液法中，半导体聚合物纳米粒子是在乳化液液滴中形成的，这就要求初始有机溶剂是不溶于水的;在再沉淀法中，半导体聚合物溶液迅速与水混合，这就需要一个与水混溶的初始有机溶剂。Landfester等［38-39］首次采用微乳液法制备了半导体聚合物纳米粒子。他们在制备过程中将半导体聚合物溶解在与水不互溶的有机溶剂(如氯仿)中，这种有机溶剂与添加了表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)的水混合之后，将有机溶剂蒸发，可以获得稳定的聚合物纳米粒子的水溶液。Masuhara等［40］使用再沉淀法制备了聚噻吩纳米粒子，后来Mc-Neill研究组［27-30］将这种方法进行改良后，首次制备了可以作为高亮度成像探针的Pdots。在再沉淀过程中，溶解聚合物的有机溶剂迅速与水混合，混合后聚合物溶解度突然下降，在聚合物链间或单链段之间疏水作用的影响下，最终形成了高荧光亮度的Pdots悬浮液。

2.2 半导体聚合物量子点的表面功能化

为了使Pdots应用于实际的生物学研究，还需要对其进行表面功能化。类似于Qdots的功能化方法，最初的研究是利用包覆的方法在纳米粒子的表面修饰相应的官能团，后来发现这种方法对Pdots的粒径和单粒子亮度有一定的影响［41］。例如PLGA聚合物或者磷脂包覆的Pdots的尺寸对于细胞和亚细胞结构来说过于巨大，而且这种方法得到的纳米粒子中半导体聚合物的含量较少，因此纳米粒子的吸收截面受到限制［42］。对于表面包覆二氧化硅的Pdots，2～3 nm厚的二氧化硅外壳可能会在生物环境中逐渐水解［43］。所以，需要开发更加有效的方法来实现Pdots的表面功能化，同时保证纳米粒子尺寸适用于细胞标记。

Chiu课题组［44-45］成功地实现了针对Pdots的表面功能化，并将其用于特异性的细胞靶向标记研究中。他们将少量具有两亲性功能基团的高分子与半导体聚合物预先共混在有机溶剂中，再利用聚合物的链间相互作用制备了表面带有功能基团的Pdots。Chiu等使用的两亲性梳状聚合物为PS-PEG-COOH，在前驱体溶液中保持半导体聚合物PFBT的浓度恒定，使PS-PEG-COOH相对于PFBT的质量百分含量控制在10% ～20%，然后利用再沉淀法制备功能化的PFBTPdots。图2(a)是利用动态光散射(DLS)测得的表面修饰的PFBT Pdots流体动力学直径分布图，图2(b)是表面修饰的PFBT Pdots的透射电镜照片。由图2(a)和图2(b)可知上述方法得到的纳米粒子粒径约为15 nm，形貌呈球形。在后续的实验中通过抗原-抗体或生物素-链霉亲和素相互作用将功能化的Pdots对细胞膜的受体分子进行特异性标记。

图2 (a)表面修饰的PFBT纳米粒子的流体动力学直径分布图;(b)表面修饰的PFBT纳米粒子的透射电镜照片。Fig.2 (a)Hydrodynamic diameter of functionalized PFBT Pdotsmeasured by DLS.(b)TEM image of functionalized PFBT Pdots.

在另一研究中，Chiu等［46］发现Pdots的荧光性质与聚合物亲水基团的含量有很大的依赖关系。他们合成了3种侧链带有不同数目羧基的PFBT Pdots(羧基的摩尔分数分别为50%，14%，2%)，研究发现羧基摩尔分数为50%的Pdots的荧光强度明显弱于其他两种Pdots。除了利用预共混的方式对Pdots进行表面功能化之外，还可以通过交联的方式将功能性高分子共价连接到Pdots的表面［47］。值得注意的是，表面修饰的聚合物纳米颗粒的单粒子荧光强度、内部结构、稳定性等特性会发生改变，因此需要严格控制Pdots的表面功能化过程［46］。近期，我们课题组采用再沉淀法制备了一种粒径约为15 nm、表面带有功能基团的含有铕配合物的纳米粒子。这种纳米粒子在水溶液中的胶体稳定性良好，克服了传统包覆方法制备的纳米粒子小分子渗漏的缺陷，并且在生物成像应用中，其荧光寿命远远比生物体的自体荧光寿命长，减少了背景荧光干扰，提高了信噪比［48］。

2.3 半导体聚合物量子点的基本特性

2.3.1 半导体聚合物量子点的粒径和形貌

纳米荧光探针的尺寸是其在生物应用中的一个重要考虑因素。纳米探针的尺寸过大会导致位阻效应，这会减弱纳米探针上靶向分子和生物分子相互作用的特异性，因此大多数生物成像实验需要尺寸较小的多功能纳米生物探针［49-50］。通常再沉淀法可以得到粒径为5～30 nm的Pdots，这种尺寸的量子点可以很好地应用在生物实验中［43］。在透射电子显微镜下，Pdots通常呈现出类似于球形的形貌，这可能是由于聚合物与水分子之间巨大的界面张力主导了其粒径和形貌［51-52］。

本课题组研究发现，除了通过改变前驱体溶液的浓度来控制Pdots的粒径之外，还可以通过在溶解聚合物的四氢呋喃溶剂中混入不同体积比(0%，30%，50%)的水来分别获得不同尺寸(16，33，59 nm)的 Pdots［53］。图3(a)、(b)、(c)分别是16，33，59 nm的Pdots单粒子荧光强度照片。

图3(d)、(e)、(f)分别是相同实验条件下相应尺寸的Pdots单粒子荧光强度直方图，蓝色曲线代表拟合曲线，得到它们强度的平均值为别为1 286，4 572，16 401，说明 Pdots的单粒子荧光随着尺寸的增大而增强。实验中还发现细胞对33 nm的Pdots摄取的最多，而16 nm的Pdots在免疫细胞标记实验中的标记效率更高。这项研究对在生物成像应用中如何选择合适尺寸的Pdots提供了指导。

图3 粒径分别为16 nm(a)、33 nm(b)、59 nm(c)的Pdots的单粒子荧光强度照片(标尺为5μm)，以及粒径分别为16 nm(d)、33 nm(e)、59 nm(f)的Pdots的单粒子荧光强度直方图。Fig.3 Single-particle fluorescence images of Pdot16(a)，Pdot33(b)，and Pdot59(c)，respectively.Scale bar represents 5 μm.Intensity histograms by analyzing single-particle brightness of hundreds of nanoparticles of Pdot 16(d)，Pdot 33(e)，and Pdot59(f)，respectively.

2.3.2 半导体聚合物量子点的光物理性质Pdots的光谱性质与聚合物分子构型密切相关。相对于聚合物分子在有机溶剂中的吸收光谱，再沉淀法得到的Pdots水溶液的吸收光谱有一定程度的展宽和蓝移［43］，这与聚合物中高分子链在弯曲、扭转的过程中引起的共轭骨架长度减少的现象相符合。图4(a)和图4(b)分别是几种常见的Pdots的吸收光谱和荧光发射光谱。由图4(a)可知，Pdots有比较宽的吸收带，在350～600 nm的范围内都有吸收。在一定波长范围内，荧光纳米粒子的光吸收能力可以由吸收截面来描述。当Pdots的浓度一定时，粒径为15 nm的单粒子的吸收截面大约是10-13cm2。这个数值在可见光和近紫外区域内是CdSe Qdots吸收截面的十到几百倍［54］。由图4(b)可知，各种Pdots在可见光区域显示出不同的发射峰。在大多数情况下，Pdots水溶液的发射光谱相对于有机溶剂中的聚合物的发射光谱表现出略微的红移，这是由于聚合物分子链塌陷、链间的相互作用增加而产生了红移聚集体［43］。这种红移现象一般是在薄膜中被观察到的［55］。

图4(a)常见的Pdots的吸收光谱;(b)常见的Pdots的发射光谱;(c)单个PFBT纳米粒子的光漂白轨迹曲线;(d)粒径约为10 nm的单个PFBT纳米粒子发射出光子数量的直方图。Fig.4 (a)Absorption spectra of common Pdots.(b)Emission spectra of common Pdots.(c)Photobleaching trajectories of single PFBT nanoparticle.(d)Histogram of the photon numbers of individual PFBT Pdots of～10 nm diameter.

单个纳米粒子的荧光亮度是由峰值吸收截面和荧光量子效率决定的。荧光量子效率定义为发射光子数目与吸收光子数目之比，它的值是评估荧光探针性能的标准之一。在早期的报道中，传统的聚合物量子点的量子效率为1% ～20%［43］。而Chiu课题组［33］研究的一些新型π-共轭聚合物量子点的荧光量子效率可接近60%，这样高荧光量子效率的Pdots可以与一些Qdots相媲美。由于Qdots通常具有较厚的壳层结构，一般掺杂染料的纳米球由于自猝灭现象导致有效的荧光团浓度仅是颗粒体积或重量的百分之几。相比之下，功能化的Pdots中的有效荧光基团浓度可达到80%以上［45］，可见Pdots是性能优异的荧光探针。

典型的荧光染料的荧光辐射速率常数约为108s-1，Pdots的荧光辐射速率常数的范围在108～109s-1［56］。在单分子成像和粒子示踪实验中测得的染料分子荧光辐射速率值往往受三线态饱和的限制。由统计分析可知，Pdots的饱和辐射速率范围在107～109s-1，这比典型的荧光染料的平均饱和辐射速率(约为106s-1)至少高出约100倍，比胶体半导体量子点的平均饱和辐射速率至少高出3个数量级［54］。拥有较快的荧光辐射速率的Pdots在流式细胞术和先进的动态成像实验中有很大的应用优势。

荧光染料或者纳米粒子的光稳定性可以由光漂白量子产率(ΦB)描述。ΦB的值等于给定时间间隔内荧光染料或者纳米粒子发生光漂白的分子数除以这段时间内吸收的光子总数。典型的荧光染料的 ΦB范围一般在 10-4～10-6［57］。Pdots的ΦB值的范围一般在 10-7～10-10［54］。单粒子的光漂白实验结果可以评估Pdots的光稳定性。如图4(c)所示，绿色曲线代表尺寸较大(＞10 nm)的PFBT Pdots的光漂白曲线，蓝色曲线代表尺寸较小的PFBT Pdots的光漂白曲线。尺寸较大的PFBT Pdots具有较多的发色团，会出现连续的光漂白现象但却无明显的光闪烁;尺寸较小的PFBT Pdots通常表现出比较明显的荧光闪烁。这表明PFBT的荧光闪烁依赖于纳米粒子自身的尺寸［58-59］。如图4(d)所示，粒径约为10 nm的单个PFBT纳米粒子的发射光子约为6×108个，比单个无机量子点的发射光子数(约107个)至少高出一个数量级［60］。

以往研究较多的两种常用的荧光探针IgGAlexa 488和 Qdot 565的发射波长范围与PFBT Pdots的发射波长范围类似。PFBT Pdots、IgG-Alexa488和Qdot565的几种光物理性质总结在表1中［45］。从表1可知，PFBT Pdots在488 nm 处的吸光系数远高于IgG-Alexa 488和Qdot 565。在488 nm激发下，PFBT Pdots(尺寸约为10 nm)的荧光比相同实验条件下的IgG-Alexa 488和Qdot 565强得多。

表1 PFBT Pdots，IgG-A lexa 488和Qdot 565的光物理特性Table 1 Photophysical properties of PFBT Pdots，IgG-Alexa 488 and Qdot565

2.3.3 半导体聚合物量子点的稳定性和生物毒性

一般来说，如果Pdots的水溶液不发生聚集，也不随着时间的变化发生分解，以及与一些生物活性组分共存时保持良好的化学稳定性，我们就可以认为Pdots在生物实验中是稳定的。我们将制备的Pdots水溶液在室温下放置几个月后，没有发现明显的聚集和沉淀，表明Pdots在水中表现了良好的胶体稳定性。然而，Pdots在含有高浓度多价金属离子的溶液中倾向于聚集。研究结果已经表明［44-45］，表面修饰可以改善 Pdots的胶体稳定性。例如，在Pdots表面涂覆一层聚电解质可以使其在高离子强度体系中保持稳定［61］。另外，可钝化 Pdots的添加剂(如牛血清白蛋白(BSA))可以使Pdots保持长期的胶体稳定性，同时降低Pdots在细胞标记实验中的非特异性结合［45］。BSA钝化的Pdots在 pH范围为4～9的环境中可以保持6个月或更长时间的稳定性，同时在许多缓冲液中(HEPES、PBS、Tris以及硼酸盐缓冲溶液等)也可以保持稳定。

生物相容性也是纳米荧光探针在生物应用中的一个重要考虑因素。许多课题组已经对Pdots的毒性进行了研究，结果都表明Pdots具有非常低的细胞毒性。例如Christensen等［62］对尺寸约为18 nm的疏水性Pdots的细胞毒性进行了研究。他们在J774.A1细胞孵育的过程中加入了不同浓度的PFBT Pdots和Cell Titer Blue(追踪细胞增殖活性的染料)。在细胞孵育18 h后，观察到实验组中加入不同浓度的Pdots的细胞的存活率与对照组中没加Pdots的细胞的存活率相差很小;内吞了Pdots的细胞没有损伤和裂解、形态正常，说明Pdots对细胞的增殖和活性没有明显的影响。

3 半导体聚合物量子点在生物学研究中的应用

3.1 细胞标记

具有小尺寸、高亮度、快速的辐射跃迁速率、良好的光稳定性以及无毒等优点的Pdots非常适合生物应用。体外细胞成像实验中，基于细胞的内吞作用可以实现Pdots对细胞的非特异性标记［54］。Pdots和 Texas Red dextran的细胞内荧光共定位方法证明了细胞可以通过胞饮作用来摄取Pdots［62］。在特定波长激发下，共聚焦显微镜可以检测到细胞内摄取的Pdots发出的强烈的荧光。由于Pdots具备高荧光亮度的特性，因此可以使用较低浓度的Pdots标记细胞，实验中最低能检测到155 pmol/L(270 ppb)的 Pdots，而且免疫荧光共定位的方法已经证实Pdots进入细胞后最终会到达溶酶体［62］。

在细胞特异性标记实验中，Pdots与生物分子进行共价连接，通过抗原-抗体或者生物素-链霉亲合素系统的相互作用再与细胞中的受体分子结合以实现细胞的特异性标记。免疫球蛋白G(IgG)和链霉亲和素(Streptavidin)广泛用于细胞靶向的免疫荧光标记。Chiu课题组［45］将表面功能化的Pdots分别与IgG和Streptavidin进行共价连接，制备了两种粒径为10～20 nm的Pdot-IgG和Pdot-streptavidin生物荧光探针并检测了它们对细胞特异性标记的能力。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种肿瘤标志物，常用来检测循环肿瘤细胞。由图5(a)可知，将人乳腺癌细胞(MCF-7)与anti-EpCAM抗体共同孵育一段时间后，使用Pdot-IgG标记可以检测到MCF-7细胞表面发出Pdots的荧光，说明Pdot-IgG探针成功地标记了MCF-7细胞。由图5(b)可知，使用Pdot-IgG标记未与anti-EpCAM抗体共同孵育的MCF-7细胞，共聚焦显微镜下没有检测到细胞表面发出Pdots的荧光。这两个实验结果说明Pdot-IgG探针可以对细胞实现高效率的特异性标记。此外，使用Pdot-streptavidin探针重复上述实验也可以得到相似的实验结果。使用流式细胞分析仪检测特异性标记的细胞表面标记物，处理流式细胞数据得到图5(c)和图5(d)。图5(c)是 Pdot-streptavidin标记细胞的荧光强度分布，图5(d)是使用Qdot565与Streptavidin制备的Qdot-streptavidin探针在相同实验条件下标记细胞的荧光强度分布。分析流式细胞仪数据可知，在标记细胞亮度方面，Pdot-streptavidin比Qdot-streptavidin的亮度高出约25倍，这个结果表明Pdots在细胞成像和生物测定等方面具有很大的应用潜力。

图5 (a)Pdot-IgG标记与一级EpCAM单克隆抗体共同孵育一段时间后的MCF-7细胞的荧光图片;(b)Pdot-IgG标记未与一级EpCAM单克隆抗体共同孵育的MCF-7细胞的荧光图片;(c)Pdot-streptavidin标记细胞的荧光强度分布;(d)与Pdot-streptavidin标记细胞实验相同条件下的Qdot-streptavidin标记细胞的荧光强度分布。Fig.5 (a)Fluorescence image of the cell-surfacemarker EpCAM on MCF-7 cells incubated sequentially with anti-EpCAM primary antibody and Pdot-IgG conjugates.(b)Fluorescence image of the control sample in which the cellswere incubated with Pdot-IgG alone(no primary EpCAM antibody).(c)Fluorescence intensity distributions for Pdot-streptavidin labeled MCF-7 cells.(d)Fluorescence intensity distributions for Qdot-streptavidin labeled MCF-7 cells obtained under identical experimental conditions as those used in(c).

在生物研究中，叠氮和炔基等基团不受生物体内各种反应的干扰和生物分子的影响，可以在复杂的生物体内和细胞环境中发生生物正交反应。表面带有羧基的Pdots与含胺的小分子(如终端带胺的聚乙二醇、炔胺分子、叠氮胺分子)连接可以获得表面带叠氮或炔基的Pdots，从而进行生物正交标记实验［44］。图6是Pdots的表面修饰和生物正交反应示意图。实验中使用含羧基的聚合物PSMA对Pdots进行表面修饰后，用一种碳二亚胺盐酸盐EDC催化表面功能化的Pdots与含胺的小分子之间的反应。随后的实验中使用Cu(Ⅰ)离子催化含叠氮基团的Pdots与终端含炔的蛋白质分子之间的生物正交反应。另一个实验中，Chiu课题组［44］使用人工氨基酸(如 AHA或HPG)标记细胞中的蛋白质，实验中可以观测到这种被标记的蛋白质通过生物正交反应与偶联了炔基的Pdots结合，从而实现高特异性的细胞靶向标记。

图6 Pdots的表面修饰和生物正交反应示意图Fig.6 Pdot functionalization and subsequent bioorthogonal labeling via click chemistry

3.2 体内成像

在光与生物体之间的相互作用中，散射、吸收和生物组织自体荧光等现象会严重干扰在体成像的荧光信号，所以生物体内荧光成像目前主要用于小动物实验，并没有广泛地应用于临床研究中。在体内成像实验中使用亮度比传统有机染料高几个数量级的近红外荧光探针可以达到更好的实验效果。Pdots具有极强的吸光能力和高度灵敏的荧光信号，因此水溶性的Pdots在生物成像应用中具有显著优势［26，33］。Kim 研究组［63］已经成功地将半导体聚合物纳米粒子应用于小鼠前哨淋巴结的体内成像实验。

荧光探针的大小、表面性能和生物体的血脑屏障等因素都会影响活体成像技术在脑肿瘤组织研究中的实验效果，因此脑肿瘤活体成像实验是一项具有挑战性的研究［64］。为此，Chiu课题组［65］开发了对深层组织渗透能力较强的尺寸约为10～20 nm的高亮度近红外荧光Pdots，并选择了对肿瘤亲和性很强的蝎氯毒素Chlorotoxin(CTX)作为肿瘤靶向配体，最终得到了与肿瘤肽配体结合的生物荧光探针。由于ND2:SmoA1型小鼠的脑肿瘤与人类的髓母细胞瘤病理相似，因此ND2:SmoA1型小鼠是很好的研究模型。他们对ND2:SmoA1转基因型(患病)和野生型(健康)两种小鼠静脉注射 Pdot-CTX和 Pdot-PEG(无CTX的对照组)两种生物荧光探针。如图7所示，对于注射Pdot-CTX的两种类型的小鼠，24 h后可以观测到野生型小鼠脑部无明显的荧光，ND2:SmoA1型小鼠脑部长有肿瘤的区域发出Pdot-CTX的强烈的荧光信号。而注射Pdot-PEG的两种类型的小鼠脑部区域均没有明显的荧光信号。这个实验结果表明靶向荧光探针Pdot-CTX会与肿瘤细胞特异性结合并在脑部肿瘤区域累积。继续观察注射Pdot-CTX的两种类型的小鼠，在静脉注射72 h后，已观测不到小鼠血液中有明显的Pdot-CTX的荧光信号。对小鼠实行安乐死后取其肾脏、脾脏和肝脏，对各种器官内的荧光强度分布结果进行分析。结果显示无论是野生型还是ND2:SmoA1型小鼠，肾脏内几乎无荧光分布的，脾脏内的荧光信号强度较低，肝脏内荧光信号则很强，说明肝脏对Pdot-CTX探针有明显的摄取，这暗示了小鼠体内的Pdot-CTX纳米荧光探针可能是经由肝脏转化为胆汁进而随粪便排出体外［66］。该研究表明基于Pdots的荧光探针在体内癌症临床诊断和治疗中具有巨大的应用潜力。

图7 健康的野生型小鼠脑的荧光成像(左)和患有髓母细胞瘤的ND2:SmoA1小鼠脑的荧光成像(右)照片。分别经尾静脉注射50μL浓度为1μmol/L非特异性的Pdot-PEG(上部)探针和特异性的Pdot-CTX(中部)探针的小鼠脑的荧光成像照片，对照组:没有接受注射的小鼠脑的荧光成像照片(底部)。Fig.7 Fluorescence imaging of healthy brains in wild-type mice(left)and medulloblastoma tumors in ND2:SmoA1 mice(right).Each mouse was injected through the tail vein with 50μL of 1μmol/L solution of either non-targeting Pdot-PEG(top)，or targeting Pdot-CTX(middle).As a control，somemice did not receive injection(bottom).

3.3 生物传感和单粒子示踪

图8 (a)掺杂PtOEP的PDHF纳米颗粒的发射光谱，插图是在氮气饱和、空气和氧气饱和条件下紫外光照射得到的Pdots水溶液的照片;(b)Pdots的单粒子荧光示踪照片。明场下一个固定的细胞的透射照片，蓝色对应与膜结合的Pdots粒子，绿色对应细胞外的Pdots粒子，红色对应细胞内部的Pdots粒子。Fig.8 (a)Emission spectra of the10%PtOEP-doped PDHF dots.The insetshows doped PDHF dots in aqueous solutions saturated with nitrogen，air and oxygen，respectively，under a UV lamp.(b)Single-particle fluorescence tracking with Pdots.Bright-field transmission image of a fixed cell.Blue corresponds to a particle bound to themembrane，green corresponds to a particle outside the cell，and red corresponds to the cell interior.

McNeill研究组［67］开发了具有内参比功能的荧光生物氧传感器，在掺杂了对氧敏感的磷光染料分子PtOEP(Platinum(Ⅱ)octaethylporphine)的Pdots中，可以发生荧光共振能量转移，从而检测生物体中的氧浓度。图8(a)是掺杂PtOEP的PDHF纳米颗粒的发射光谱。在不同氧浓度下，在420 nm处的聚合物PDHF的发射峰几乎不变，而在650 nm处的PtOEP的发射峰值则随着氧气浓度的减少而增大。图8(a)插图为在365 nm紫外灯照射下的照片:在氮气饱和条件下，Pdots水溶液发射强烈的荧光;在空气气氛下，Pdots水溶液发射较弱的荧光;在氧气饱和条件下，由于氧气猝灭导致Pdots水溶液发射出微弱的荧光。近期，本课题组利用Tb3+与表面带有羧基的Pdots反应形成螯合物，然后在螯合物溶液中加入一定浓度的细菌芽孢标记物CaDPA(Calcium dipicolinate)，最后得到了具有内参比功能的荧光传感器，能够检测水溶液中的细菌芽孢［68］。

纳米尺度的二维和三维的单粒子示踪技术在细胞生命活动(马达蛋白的运动、分子运输、生物膜动力学等)的研究中有很多的应用［3，5］。McNeill等［69-70］研究了Pdots在纳米尺度的二维和三维的粒子示踪技术中的应用。他们使用倒置荧光显微镜CCD成像系统对单个纳米颗粒进行图像采集，分析了20个典型的单个纳米颗粒的荧光强度轨迹，结果表明:单个聚合物纳米颗粒发射的光子数平均约为109个，甚至可以超过1010个。这种检测方法理论上可以达到1 nm的分辨率。图8(b)是Pdots的单粒子荧光示踪照片，Pdots可以与细胞的某些组分发生可逆或不可逆的结合，从而进行粒子追踪，表明Pdots在检测细胞中某些生物分子和亚细胞结构的迁移活动等研究中具有应用潜力。

3.4 药物传输和光动力学疗法

纳米医药技术可以将药物或者其他活性物质特异性地输送到病患组织［71］。疏水的Pdots可作为输送载体，利用载体的屏蔽作用可以保护药物。药物被包覆在Pdots内部或者与Pdots共价连接，在生物体内被输送到患病组织处再被释放出来［72］。目前纳米医药的研究热点之一是如何开发合适的Pdots使之用于药物和基因传递。Wang等［73］将偶联了抗癌药物阿霉素(Doxorubicin)的聚谷氨酸包覆在聚合物PFO的内部，当到达病灶部位时，释放出的阿霉素会猝灭PFO的荧光，所以可以通过监测PFO的荧光强度的变化来判断释放的药物浓度的情况。

光动力学疗法(Photodynamic therapy，PDT)是一种新型的癌症临床治疗方法。在PDT当中，光敏剂可以和生物组织中的氧分子反应产生活性氧(ROS)，如对生物组织有毒的单线态氧(1O2)和氧自由基，从而杀死癌细胞。PDT可以在有限的区域内产生疗效，并不会损坏病灶周围的健康组织和细胞，所以在癌症治疗的临床研究中已经成为一种重要的方法［74］。荧光共轭聚合物量子点自身可以作为光敏剂与生物体中的氧作用生成1O2。Wang等［75］制备了一种水溶性的含有卟啉的聚噻吩。在黑暗条件下，这种聚噻吩-卟啉复合聚合物对细胞没有毒性;在光激发条件下，能量从聚噻吩骨架转移到卟啉单元，从而诱导氧分子产生1O2，进而有效地杀死邻近的癌细胞。

4 结论

半导体聚合物纳米粒子具有尺寸小、亮度高、辐射跃迁速率快、光稳定性和生物相容性好等优异特性。这种荧光探针在许多重要的领域，如荧光成像、生物传感、药物传输以及疾病诊断和治疗等领域中有广泛的应用。进一步优化半导体聚合物纳米粒子的光学性能和表面特性，探索开发多功能的纳米荧光探针可为今后的多模态医学成像、疾病诊断和治疗等领域的研究提供有意义的指导和帮助。

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