妊娠期绵羊不同程度高原缺氧模型的建立

胡劼，李华，焦明克，段瀚宇

我国新疆地区有帕米尔、阿里两大高原，有喀喇昆仑山、昆仑山、天山等多个平均海拔5000m以上的山系，高海拔地区总面积可达60万平方千米，这些地区空气稀薄，氧含量低，是高原缺氧疾病的高发地带。研究显示，当母体处于低氧环境，动脉氧分压降为40mmHg时，其体内胎儿的动脉氧分压可降至10～12mmHg，造成胎儿缺氧状态[1]。这种状态不仅造成胎儿血流和体内氧分子的重新分布，还可导致胎儿发生缺氧应激反应[2]，引发多种器官组织病理改变，从而引起胎儿生长受限、发育异常。研究还显示，许多慢性成人疾病具有“胎儿起源”，即妊娠期缺氧会影响后代发展，增加后代在成年期患冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压及糖尿病等代谢性疾病的风险[3]，但目前还缺乏有效的研究妊娠期缺氧母体及胎儿改变的动物模型。为此本研究应用西北人工实验舱建立妊娠期绵羊不同程度高原缺氧模型，并进行缺氧指标及氧化损伤标志物的检测，评估判断该造模方法的可行性并初步探讨高原低氧环境对妊娠期母体及胎儿的影响。

1 资料与方法

1.1 实验材料 西北地区特殊环境实验舱(DYC-3013M)由兰州军区乌鲁木齐总医院研制。分光光度计(ND-NDL-US-CAN)、荧光计(FM 109534)购自Thermofisher公司。丙二醛TBARS定量分析试剂盒(STA-330)购自Cell BioLabs公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及高原缺氧模型制备 人工授精配种成功的妊娠期绵羊24只，体重25～35kg，由兰州军区乌鲁木齐总医院实验动物中心提供。将24只妊娠期绵羊随机分为平原对照组(low altitude control group，LAC)组、轻度低氧暴露组(m ild hypoxia exposure group，MHE)组及重度低氧暴露组(severe hypoxia exposure group，SHE)共3组(n=8)。LAC组于平原环境人工实验舱饲养，低氧暴露组于低压高寒环境人工实验舱中饲养，期间动物均自由饮水进食，MHE和SHE组均每隔24h开舱30m in添加水及饲料，低氧暴露持续整个妊娠期。其中，LAC人工实验舱温度为20℃，湿度11.0g/m3，O2含量260g/m3，压力100.0kPa；MHE人工实验舱温度为5℃，湿度3.68g/m3，O2含量206g/m3，压力67.7kPa，调节实验舱内高度以10m/s的速度匀速上升至海拔3000m水平，以模拟西北地区海拔3000m环境；SHE人工实验舱温度为–6℃，湿度1.77g/m3，O2含量166g/m3，压力54.1kPa，调节实验舱内高度以10m/s的速度匀速上升至海拔5000m水平，以模拟西北地区海拔5000m环境。该人工实验舱根据随海拔升高，气压降低，空气密度减小，空气成分不变的物理原理，采用减压装置使密闭舱内压力降低，密度减小，从而模拟所需的高原低氧环境。

1.2.2 动物模型氧合状态评估 所有实验动物检测经皮血氧饱和度(SpO2)及动脉血氧饱和度(SaO2)。将空腹妊娠期绵羊卧位固定于解剖台上，伸展后肢向外伸直，暴露腹股沟三角动脉搏动部位，剪毛，碘酒消毒。注射器抽取625U/m l肝素钠0.2m l，转动注射器使其内均匀附着肝素。左手手指触及股动脉跳动处，穿刺动脉取鲜红血液2m l，用干药棉压迫止血2～3m in。拔针同时立即排空气泡，将针头迅速刺入橡皮塞，平稳静置送至检验科于2h内完成检测。共检测6次，时间点分别为进舱建模前(0d)及进舱建模后第7、15、30、90、120d。

1.2.3 动物模型一般情况监测 分别于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d连续观测并记录所有孕羊的体温、呼吸、心率、血压、饮食情况和行为运动情况。

1.2.4 氧化应激反应评价 分别于建模前(0d)及建模后7、15、30、90、120d穿刺取妊娠期绵羊肝脏组织，所有取出组织(0.1～0.2g)以1:20的比例加入冰冷0.01mol/L磷酸盐缓冲液，用匀浆器在0～4℃下制成匀浆液，进行蛋白质氧化损伤的生物标志物羰基(carbonyl groups，CO)、细胞氧化损伤的生物标志物丙二醛(malondialdehyde，MDA)的检测，用于评价妊娠期绵羊缺氧模型体内的氧化损伤程度。其中，CO检测采用分光光度法[4]，MDA检测采用硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)定量分析法，TBARS涵盖了大部分氧化损伤导致的醛酮类物质，是衡量脂质过氧化的指标之一[5]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以表示，两组总体均数间比较采用t检验，组内各亚组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同海拔高度对妊娠期绵羊氧合状态的影响观察不同时间点妊娠期绵羊的SpO2(mm Hg)及SaO2(%)，结果显示：在造模第0天和7天，3组动物间无统计学差异(P＞0.05)。从造模第15d开始直到造模第120天，MHE组及SHE组SpO2和SaO2水平明显低于LAC组(P＜0.05)，且SHE组明显低于MHE组(P＜0.05，表1)。按照30mmHg＜PaO2＜60mmHg且60%＜SaO2＜90%为轻度缺氧的诊断标准，造模30d时MHE动物造模成功；按照PaO2＜30mm Hg且SaO2＜60%为重度缺氧的诊断标准，造模90d时SHE动物造模成功。最终得出应用人工实验舱模拟西北地区高原低氧气候环境，建立轻度缺氧妊娠期绵羊模型的具体条件为温度5℃，湿度3.68g/m3，空气中O2含量206g/m3，压力67.7kPa，高度以10m/s的速度匀速上升到海拔3000m水平，造模用时30d；建立重度缺氧妊娠期绵羊模型的具体条件为温度–6℃，湿度1.77g/m3，空气中O2含量166g/m3，压

表1 3组妊娠期绵羊不同时间点SpO2(mmHg)及SaO2(%)结果对比(±s, n=8)Tab. 1 SpO2 (mmHg) and SaO2 (%) in pregnant sheep of 3 groups at different time points (±s, n=8)

LAC. Low altitude control group; MHE. M ild hypoxia exposure group; SHE. Severe hypoxia exposure group; (1)P＜0.05 compared with LAC;(2)P＜0.05 compared with MHE

Group 0d 7d 15d 30d 90d 120d SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 SpO2 SaO2 LAC 85±4 96±3 84±5 95±4 86±2 97±1 83±4 93±6 82±5 92±2 87±1 94±3 MHE 83±3 94±4 81±3 91±2 73±4(1) 83±5(1) 56±3(1) 72±2(1) 43±2(1) 67±4(1) 40±3(1) 70±2(1)SHE 86±2 95±3 79±5 90±1 44±3(1)(2) 70±6(1)(2) 29±2(1)(2) 55±1(1)(2) 24±1(1)(2) 42±3(1)(2) 22±4(1)(2)38±3(1)(2)

力54.1kPa，高度以10m/s匀速上升至海拔5000m水平，造模用时90d。

2.2 不同海拔高度对妊娠期绵羊生命体征及行为状态的影响 建模前至建模后30d，各组妊娠期绵羊各项生命体征及一般情况变化不明显；从建模后90d开始，MHE组及SHE组动物的呼吸频率较LAC组降低(P＜0.05)，心率较LAC组升高(P＜0.05)，运动减少，SHE组动物的饮食较其他两组减少；各组间妊娠期绵羊其余生命体征未发现明显改变(表2)。

表2 建模后90d不同分组妊娠期绵羊生命体征及一般情况结果对比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

表2 建模后90d不同分组妊娠期绵羊生命体征及一般情况结果对比(±s, n=8)Tab. 2 Vital signs and general status in 3 groups of gestational sheep 90 days after modeling (±s, n=8)

(1)P＜0.05 compared with LAC

Group Body temperature (℃) Breath (/m in) Heart rate (/m in)Systolic pressure (kPa) Diastolic pressure (kPa) Diet Movement LAC 37.7±0.5 18.0±2.0 70.0±4.0 15.9±0.7 9.3±0.9 Normal Normal MHE 36.3±0.4 14.0±2.0(1) 77.0±2.0(1) 17.3±0.5 10.5±0.4 Normal Reduced SHE 36.9±0.5 12.0±1.0(1) 78.0±3.0(1) 18.1±0.3 11.1±0.8 Reduced Reduced

2.3 不同海拔高度对妊娠期绵羊氧化应激的影响

图1 建模后120d不同分组妊娠期绵羊氧化应激的生物标志物结果对比Fig.1 Results of oxidative stress biomarkers in 3 groups of gestational sheep 120 days after modeling(1)P＜0.05 compared with LAC group; (2)P＜0.05 compared with MHE group

建模前至建模后90d，MHE组及SHE组妊娠期绵羊的CO和MDA水平与LAC组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；从建模后120d开始，MHE组及SHE组妊娠期绵羊的CO和MDA水平均明显高于LAC组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且SHE组CO、MDA水平明显高于MHE组，差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。

3 讨 论

医学上将海拔高度为3000m以上的地区称为高原。我国高原地域辽阔，占全国土地总面积的26%[6]。这些地区空气稀薄，低温低氧，这种高原低氧环境在系统水平、器官水平、细胞水平、分子水平甚至基因水平都可对人体功能产生多种负面影响。

高原低氧环境对妊娠期母体和胎儿都会产生巨大影响。严重的长时间氧气供应不足会导致胎儿脑组织发生不可逆的损伤[7]。缺氧可导致胎儿消化道黏膜损伤，引起新生儿坏死性小肠结肠炎。缺氧引起的酸中毒会导致胎儿的心脏糖原耗竭，显著降低其心脏的能量和氧气供应。缺氧可诱导胎儿体内基质金属蛋白酶(MMPs)表达失衡[8]，炎性细胞因子表达上调，引发胎儿大脑和心脏组织重塑、心肌双核化过程延迟[9]，这些都会导致胎儿生长和发育的异常。

目前关于高原低氧环境对妊娠期母体及胎儿影响的研究还比较有限，一是因为高原环境恶劣，现场研究不便于实施，二是因为尚未建立较为简便有效的动物模型供研究使用。基于此，本研究通过调整人工实验舱温度、湿度、压力和氧含量等指标，最大化地模拟西北地区高原低氧环境，成功制备出不同程度的妊娠期绵羊缺氧动物模型。本研究结果显示，在模拟西北高原低氧环境的人工实验舱中饲养90d后，妊娠期绵羊出现呼吸频率减低、心率加快、运动及饮食减少的现象，且不同程度低氧环境暴露下，妊娠期绵羊的SpO2、SaO2水平，饮食情况及氧化损伤程度不同，表明缺氧环境造成了动物生命体征和行为的改变，与之前的一些研究报道相符[1,10]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(react ive nit rogen species，RNS)是引起蛋白质氧化损伤的重要因素[11-13]，可通过多种代谢途径产生，易与细胞内的大分子物质反应，引起细胞结构的广泛病理损伤[3]。因此通过检测由自由基介导的蛋白质及脂质氧化产物可评估体内是否发生了氧化性损伤[14]。在模拟西北高原低氧环境的人工实验舱中饲养120d后，妊娠期绵羊肝组织内氧化应激生物标志物CO、MDA含量上升，表明高原低氧环境诱发了动物体内的氧化应激反应，引起妊娠期母体体内蛋白质和脂质的氧化损伤。

本研究结果表明，在平原地区也可以通过对人工实验舱的各项参数进行精确控制，完成所需的高原特殊环境下动物模型的制备，省钱省力，操作简单，便于推广。我们在造模过程中还观察到在高原低氧环境下妊娠期绵羊多项指标的改变，提示妊娠期缺氧对母体内环境产生了较大影响，后续实验中，我们还将通过检测胎儿蛋白质组学和基因组学的改变，继续观察高原低氧环境对不同妊娠期母体绵羊体内胎儿心血管系统、泌尿系统和生殖系统发育的具体影响，以期为妊娠期高原缺氧性疾病的发病机制及干预研究提供理论依据。

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