慢性乙型肝炎以及肝硬化患者肠道微生物研究

陈萌萌，郑吉顺，刘艳艳，李家斌

慢性乙型肝炎以及肝硬化患者肠道微生物研究

陈萌萌1，2，郑吉顺3，刘艳艳2，李家斌1

摘要目的 探讨慢性乙型肝炎以及肝硬化患者的肠道菌群变化及其与细胞因子、肝功能之间的关系。方法 选取30例健康志愿者、50例肝炎后肝硬化患者以及50例慢性乙型肝炎患者，采用实时荧光定量PCR法检测粪便中九种肠道菌群含量，比较三组间肠道菌群变化；同时采用ELISA法检测慢性乙型肝炎患者血清中细胞因子如白介素17A（IL17）、白介素1β（IL1β）、白介素6（IL6）、干扰素α（INFα）、CXC趋化因子（CXCL13）的浓度，分析肠道菌群与细胞因子以及肝功能之间的关系。结果 与健康对照组相比，慢性乙型肝炎以及肝硬化患者体内的双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌属以及瘤胃球菌属含量减少；肠杆菌科细菌、肠球菌、梭菌属、白色念珠菌以及普雷沃氏菌含量明显增加。慢性乙型肝炎患者体内的肠杆菌科细菌与凝血酶原时间（PT）呈正相关性，肠球菌与谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）呈正相关性；双歧杆菌与AST、碱性磷酸酶（AKP）以及HBV DNA水平呈负相关性，普雷沃氏菌属与AST、AKP以及PT呈负相关性，拟杆菌属与AST和PT呈负相关性，瘤胃球菌属与白蛋白（ALB）呈负相关性。另外，9种肠道菌群中只有肠球菌与IL17A呈正相关性。结论 慢性乙型肝炎以及肝硬化患者体内存在不同程度的肠道菌群失调，其中乙肝患者体内过度繁殖的肠球菌与IL17A协同参与肝脏炎症反应过程，以致于肝功能受损呈恶性循环状态。

关键词慢性乙型肝炎；肠道微生物；肝功能；细胞因子

2015-01-22接收

作者单位：

1安徽医科大学第一附属医院感染科，合肥 230022

2安徽省细菌耐药监控中心，合肥 2300223合肥市第一人民医院感染科，合肥 230012

肠道菌群寄居在人体胃肠道内各个部位，是一个种类繁多、动态变化的微生物群体。随着对“肠-肝轴”概念的深入认知以及肠道微生态学研究的不断进展，肠道菌群与慢性肝病的关系引起了广泛的关注。既往研究［1-2］表明，慢性乙型肝炎患者的肝脏功能受到损伤后，可通过肠-肝轴改变胆汁的分泌、减少肠道的血供和蠕动等因素，导致肠道黏膜的破坏和肠道菌群失衡。但究竟是哪种肠道微生物在肝病发生发展中起着关键作用，其作用机制与细胞因子是否有关联，目前尚不明确。该研究采用荧光定量PCR法检测正常人、慢性乙型肝炎以及肝炎后肝硬化患者的肠道菌群，旨在阐明肠道菌群在肝病发展中所起的作用，并且对慢性乙型肝炎患者的肠道菌群与细胞因子以及肝功能之间的关系作进一步探讨。

1　材料与方法

1.1 标本来源 50例慢性乙型肝炎患者和50例肝炎后肝硬化患者的粪便标本来源于安徽医科大学第一附属医院2012年7月～2014年2月住院患者，30例健康志愿者的粪便标本来源于安徽医科大学第一附属医院体检中心（所有研究对象均签署知情同意书并上报医院伦理委员会批准），临床诊断符合2011年版中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准。病例入选条件：血清学乙肝标志物表面抗原阳性病史超过6个月，现在或曾有过肝功能异常，排除合并其他原因引起的肝功能损害；患者两周内未服用任何护肝抗病毒的药以及抗生素。研究对象的临床资料比较见表1。

表1　3组人群临床资料比较（±s）

表1　3组人群临床资料比较（±s）

与健康对照组比较：*P＜0.05；与慢性乙型肝炎组比较：＃P＜0.05；TBIL：总胆红素；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALB：白蛋白；GGT：谷氨酰转移酶；AKP：碱性磷酸酶；PT：凝血酶原时间

项目　　健康对照组　　慢性乙型肝炎组肝炎后肝硬化组人数（n）30　50　50性别（男／女）　14／16　16／34　12／38年龄（岁）　36.5±10.7　40.8±14.7　53.2±11.3粪便湿重（g）　198.4±23.9　200.4±21.2　201.4±23.2 TBIL（μmol／L）　12.7±3.2　45.6±43.4*　101.4±157.0*ALT（U／L）　23.9±5.8　682.8±668.9*　117.3±225.9*＃AST（U／L）　21.8±4.0　548.5±609.2*　123.3±173.0*＃ALB（g／L）　47.9±2.7　39.9±4.2*　31.5±7.9*＃GGT（U／L）　24.7±7.6　128.8±78.3*　119.7±143.3*AKP（U／L）　60.9±9.7　111.4±57.1*　151.3±94.7*＃PT（s）　12.0±0.4　14.1±2.2　17.6±14.0*HBV DNA水平（IU／ml）　　—6.7±13.0　6.8±14.0

1.2 标本采集 清晨采集隐血实验阴性并且未被尿液污染的尾便于无菌容器中，将粪便搅匀后，用电子天平称取200 mg分装于无菌EP管中保存于-80℃待用。另外采集慢性乙型肝炎患者空腹静脉血3 ml，分离血清后-20℃冷冻保存待测。

1.3 试剂与仪器 QIAmp DNA Stool Mini Kit试剂盒、Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪购自德国Qiagen公司；TaKaRa SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒、TaKaRa Taq酶、TaKaRa Easy dilution、TaKaRa Mini-BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒以及pMDTM18-T Vector购自大连宝生物有限公司；细胞因子试剂盒购自武汉新启迪生物有限公司；TProfessional Thermocycler PCR仪购自德国Biometra公司；Tanon 5200 multi凝胶成像系统购自上海天能公司；Multiskan MK3酶标仪购自上海Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 粪便总DNA的抽提 使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒法抽提粪便总DNA。将200 mg粪便与缓冲液ASL混匀，置于95℃水浴5 min，加入EXTablet抑制剂，室温静置后加入蛋白酶K和缓冲液AL。用乙醇沉淀DNA过柱洗脱后溶解于70 μl AE中，-80℃保存备用（具体抽提过程严格按照试剂盒说明书要求进行）。

1.4.2 常规PCR反应 9种肠道菌群的引物均参照相关文献［3-6］，并用BLAST软件在线核实其特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表2。以提取的粪便总DNA为模板，采用25 μl反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP （2.5 mmol／L）2 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶（5 U／μl）0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 17.5 μl。扩增反应条件：94℃预变性8 min，94℃变性1 min，退火45 s，72℃延伸30 s（双歧杆菌45 s），循环32次，72℃后延伸10 min，4℃保存。取PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中分析扩增结果。

1.4.3 标准品质粒的构建 将PCR扩增产物进行切胶回收纯化并与pMDTM18-T载体连接，转化到JM109感受态细胞中，经蓝白斑筛选，随机挑取4个白色克隆。菌落PCR鉴定得到阳性克隆后，提取并纯化质粒DNA，送至大连宝生物工程有限公司测序。用紫外分光光度计准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，作为标准品保存于-20℃备用。

表2　9种肠道菌群的引物序列以及PCR反应条件

1.4.4 标准曲线的建立 以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板进行实时荧光定量PCR。采用20 μl反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl，模板2 μl，上、下游引物各0.8 μl，DEPC-ddH2O 6.4 μl。PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性8 s，退火20 s，72℃10 s（拟杆菌属、乳酸杆菌、白色念球菌20 s，普雷沃氏菌属以及双歧杆菌30 s），循环40次。用起始模板拷贝数的lg值对每个稀释标准品的CT值绘图，最终得到标准曲线。

1.4.5 肠道菌群的定量检测 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件同上，对研究对象的DNA样品进行检测，同时设置空白对照。每个样品要设置复孔并取平均值（复孔CT值相差不得超过0.5），根据测得的CT值与标准曲线得到样品中DNA拷贝数。

1.4.6 细胞因子的检测 按照ELISA试剂盒说明书检测血清中细胞因子白介素（interleukin，IL）-17A、IL-1、IL-6、干扰素-α（interferon-α，INF-α）、CXC趋化因子13（C-X-C motif chemokine 13，CXCL-13）水平，并用酶标仪记录这些细胞因子的浓度。

1.5 统计学处理 用SPSS 16.0统计软件进行分析，定量检测所得的DNA拷贝数经对数转换后以±s表示，两组间比较采用t检验，多组资料比较采用单因素方差分析，两两指标的相关性采用Pearson相关性分析。

2　结果

2.1 引物特异性检测 用1%琼脂糖凝胶电泳分析常规PCR产物，以Marker为标准。可见常规PCR产物均显示特异性条带，与目的DNA片段长度相吻合。见图1。

2.2 3组间肠道菌群的比较 与健康对照组相比，慢性乙型肝炎组和肝炎后肝硬化组的肠杆菌科细菌、肠球菌、梭菌属、白色念珠菌以及普雷沃氏菌属计数均显著增加（P＜0.05）；而双歧杆菌、拟杆菌属以及瘤胃球菌属计数均显著减少（P＜0.05）。从DNA拷贝数来看，肝炎后肝硬化组的变化趋势远比慢性乙型肝炎组明显。慢性乙型肝炎组的乳酸杆菌数量比健康对照组显著减少（P＜0.001）；肝炎后肝硬化组的乳酸杆菌数量虽然比健康对照组有所减少，但两组间差异无统计学意义。另外，肝炎后肝硬化组的乳酸杆菌和瘤胃球菌属的数量明显高于慢性乙型肝炎组（P＜0.05），其它菌属比较两组间差异无统计学意义。见表3。

2.3 慢性乙型肝炎患者的肠道菌群与肝功能以及HBV DNA水平之间的相关性分析 肠杆菌科细菌与PT呈正相关性（r＝0.29，P＝0.04）；肠球菌与ALT（r＝0.31，P＝0.03）以及AST（r＝0.29，P＝0.04）呈正相关性。双歧杆菌与AST呈负相关性（r＝-0.37，P＝0.01），也与AKP（r＝-0.34，P＝0.02）以及HBV DNA水平（r＝-0.18，P＝0.05）呈负相关性。同样的，普雷沃氏菌属与AST呈负相关性（r＝-0.56，P＜0.001），也与AKP （r＝-0.30，P＝0.03）以及PT（r＝-0.29，P＝0.04）呈负相关性。拟杆菌属与AST（r＝-0.44，P ＝0.01）和PT（r＝-0.37，P＝0.01）呈负相关性，而瘤胃球菌属只与ALB呈负相关性（r＝-0.40，P＝0.01）。见表4。

表3　3组间肠道菌群的比较（±s）

表3　3组间肠道菌群的比较（±s）

与健康对照组比较：*P＜0.05；与慢性乙型肝炎组比较：＃P＜0.05

肠道菌群　　健康对照组（n＝30）慢性乙型肝炎组（n＝50）肝炎后肝硬化组（n＝50）肠杆菌科细菌　7.60±0.46　8.37±1.11*　8.85±0.84*粪肠球菌　5.72±0.42　6.90±1.00*　7.22±0.90*双歧杆菌　8.31±0.96　7.49±1.16*　7.53±1.20*乳酸杆菌　8.46±1.42　6.92±1.36*　8.17±1.46＃梭菌属　7.44±1.07　9.24±1.13*　9.68±0.98*白色念珠菌　5.83±0.23　6.28±0.29*　6.36±0.40*普雷沃氏菌属　8.00±1.47　9.28±1.73*　9.59±1.52*拟杆菌属　10.95±0.41　10.16±1.11*　9.96±1.38*瘤胃球菌属　6.68±0.99　5.69±0.68*　6.09±0.74*＃

表4　慢性乙型肝炎患者的肠道菌群与肝功能以及HBV DNA水平之间的相关性分析

2.4 慢性乙型肝炎患者的肠道菌群与细胞因子之间的相关性分析 9种肠道菌群中只有肠球菌与IL-17A呈正相关性（r＝0.29，P＝0.04）。

3　讨论

全球约有20亿人口感染HBV，其中约有10% ～20%慢性乙型肝炎患者最终发展为失代偿期肝硬化或肝癌，严重危害人类健康［7］。因此为有效救治慢性肝病患者，进一步揭示其发生发展的规律和机制，探索适当的干预和治疗措施显得尤为迫切。

本研究通过对9种肠道代表菌群的定量检测，发现慢性乙型肝炎以及肝硬化患者体内存在不同程度的菌群失调，表现为双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌属以及瘤胃球菌属含量减少；肠杆菌科细菌、肠球菌、梭菌属、白色念珠菌以及普雷沃氏菌含量明显增加，与Liu et al［3］研究结果一致。肠杆菌科细菌在正常情况下属于肠道非优势菌群，只有在特定的条件下具有侵袭性而对人体造成伤害。最新研究［6，8］表明肝硬化患者体内的肠杆菌科细菌异常增多，而血浆内毒素水平与肠杆菌科细菌数量呈正相关性，过度繁殖的肠杆菌科细菌产生大量的内毒素释放到肠腔内，抑制肠上皮细胞的蛋白质合成，继而导致肠道屏障受损，出现细菌易位和肠道菌群失调，菌群失调又会加重肠杆菌科细菌过度繁殖，如此形成恶性循环。白色念珠菌在正常人肠道中含量极少，却在慢性肝病患者肠道内大大增加，这可能与患者延迟排便以及肠道活性降低有关［5］。文献［9］已证实，慢性乙型肝炎患者的肝功能受损后会导致补体合成减少，使得机体免疫力下降以及网状内皮细胞功能受损，进而导致条件致病菌如白色念珠菌迅速增殖。另外，肝硬化患者的肝功能严重受损，肠黏膜氧化应激造成肠黏膜屏障功能减退，肠道通透性增加，最终可能引发真菌感染［10］。

Arumugam et al［11］对22名志愿者的肠道微生物宏基因组进行测序比对，发现人体肠道中的微生物并非随机组合，而是可以分为拟杆菌属、普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属3个肠型，并且这些肠型与宿主的年龄、性别、种族、体重指数以及地域环境无关。肠道分型概念提出以后，不少研究者试着找出疾病与肠道分型之间的关联，以便于筛选和预防某种疾病，最大限度地控制疾病的发生发展。本研究通过定量检测以上3种菌属发现健康志愿者的拟杆菌属含量高，肝病患者的普雷沃氏菌属含量增加而拟杆菌属含量减少。初步推测健康志愿者的肠道菌群属于1类肠型，而慢性乙型肝炎以及肝硬化患者的肠道菌群属于2类肠型。若要明确慢性肝病患者的肠道分型，还有待通过定量观察微生物生态学（QIIME）技术做进一步的研究。

IL-17A是近年发现的一种新型促炎性细胞因子，可以促进IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素E2和基质金属蛋白酶等的表达，引发组织细胞通透性增加，甚至坏死［12］。本研究结果表明，慢性乙型肝炎患者体内肠球菌与IL-17A呈正相关性，可能是由于乙肝患者体内肠球菌迅速繁殖，并产生大量多形核白细胞趋化因子［13］，介导肝脏发生炎症反应，使得大量细胞因子（尤其是TGF-β、IL-23、IL-1β）释放，Th-17细胞被活化，通过分泌并活化IL-17A来上调相关细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-23 P19等，而这些细胞因子又会进一步加重肝脏的炎症反应和损伤［14］。另外，研究显示肠杆菌科细菌和肠球菌与反应肝脏损伤严重程度指标—肝功能以及PT呈正相关性，而乳酸杆菌与拟杆菌属以及瘤胃球菌属等益生菌与部分肝功能呈负相关性。这进一步说明慢性乙型肝炎患者的肠道菌群结构变化对肝脏组织有损伤作用，是HBV相关性肝病发生发展中不容忽视的致病因素。

综上所述，慢性乙型肝炎以及肝硬化患者体内存在不同程度的肠道菌群失调，其中乙肝患者体内过度繁殖的肠球菌与IL-17A协同参与肝脏炎症反应过程，使肝功能受损呈恶性循环状态。因此，合理使用有效的微生态制剂来抑制肠道潜在致病菌的繁殖，对延缓和预防肝硬化的发生有着重要临床意义。

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Changes of intestinal microbiota in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis

Chen Mengmeng1，2，Zheng Jishun3，Liu Yanyan2，et al
（1Dept of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；
2Anhui Center for Surveillance of Bacterial Resistance，Hefei 230022；
3Dept of Infectious Diseases，The First People’s Hospital of Hefei，Hefei 230012）

AbstractObjective To investigate changes of intestinal flora and correlation with cytokines and liver function in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis.Methods 30 healthy subjects，50 patients with chronic hepatitis B and 50 patients with cirrhosis were selected.Nine kinds of intestinall flora were quantified by FQ-PCR to compare the changes among three groups.Then the IL-17A，IL-1β，IL-6，IFN-α，CXCL-13 concentrations in the serum of patients with chronic hepatitis B were measured with ELISA to explore the relationship between intestinal flora and cytokines，liver function.Results The numbers of Bifidobacterium，Lactobacillus，Bacteroides and Ruminococcus were significantly decreased in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis compared with healthy controls，while the numbers of Enterobacteriaceae，Enterococcus，Clostridium，Candida albicans and Prevotella were significantly increased.Positive correlations were found between Enterobacteriaceae and PT，as well as Enterococcus and ALT，AST in patients with chronic hepatitis B.Bifidobacterium was negatively linked to AST，AKP，HBV DNA.Prevotella was negatively linked to AST，AKP，PT.There was a negative correlation between Ruminococcus and ALB，as well as Bacteroides and AST，PT.In addition，Enterococcus was positively linked to IL-17A.Conclusion Varying degrees of intestinal flora imbalance exists in patients with chronic hepatitis B and liver cirrhosis.The overgrowth of Enterococcus acts synergistically with IL-17A to induce liver inflammation and result in impaired liver function.

Key wordschronic hepatitis B；intestinal microbiota；liver function；cytokines

作者简介：陈萌萌，女，硕士研究生；李家斌，男，教授，博士生导师，责任作者，Email：lijiabin948＠vip.sohu.com

基金项目：国家自然科学基金（编号：81172737）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0648-05

中图分类号R 512.6