NMDAR/PSD-95/nNOS复合物在神经病理性疼痛中的研究进展

刘成全，颜天华*，陈 荣

1中国药科大学生理教研室，南京 210009;2江苏欧威医药有限公司，南京 210042

NMDAR/PSD-95/nNOS复合物在神经病理性疼痛中的研究进展

刘成全1，颜天华1*，陈 荣2

1中国药科大学生理教研室，南京 210009;2江苏欧威医药有限公司，南京 210042

神经病理性疼痛是一种常见的慢性疼痛疾病，发病机制复杂且临床治疗效果欠佳。最近研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸受体/突触后致密蛋白95/神经元型一氧化氮合酶（NMDAR/PSD-95/nNOS）复合物在神经病理性疼痛中发挥重要作用。研究发现，如果不直接抑制NMDAR或nNOS，选择性阻断NMDAR/PSD-95或者nNOS/PSD-95的相互作用，可以在不影响NMDAR和nNOS生理功能的前提下抑制神经病理性疼痛中NO的病理性释放，可能获得没有明显副作用的安全有效的神经病理性疼痛的治疗药物。故本文对NMDAR/PSD-95/nNOS复合物在神经病理性疼痛中的研究进展进行综述。

神经病理性疼痛；NMDAR；PSD-95；nNOS

神经病理性疼痛是一种以自发痛（spontaneous pain）、痛觉异常（allodynia）和痛觉过敏（hyperalgesia）为特点的慢性疼痛疾病[1]。流行病学调查表明，有7%～8%的人一生中经历过神经病理性疼痛的困扰[2]。除了熟知的三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、糖尿病神经痛外，也可见于脑卒中后、各类脊髓病变、各类周围神经病、帕金森病及多发性硬化等疾病。目前临床上用于治疗神经病理性疼痛的药物主要包括抗抑郁药、抗癫痫类药物、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂、阿片类药物和非甾体类抗炎药等。神经病理性疼痛由于其发病率高 （在糖尿病、脊髓损伤患者中的发病率分别高达26%、67%）[3]，且已有的治疗神经病理性疼痛的药物疗效欠佳及其严重的不良反应，使得神经病理性疼痛的研究已经成为疼痛领域的难点和热点。

研究表明，由谷氨酸过度激活NMDA受体介导的中枢敏化(Central sensitization）在痛敏的产生和维持方面起关键作用，突触后致密蛋白95（PSD-95）是一种支架蛋白，在突触后膜与NMDA受体和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）通过蛋白-蛋白相互作用形成NMDAR/PSD-95/nNOS信号分子复合物，进而激活nNOS引发神经病理性疼痛[4]。NMDAR和nNOS抑制剂的研发曾经成为镇痛药物研发的热门方向，但是由于NMDAR和nNOS在学习和记忆等许多中枢神经系统功能的重要性，直接抑制NMDAR或nNOS会产生许多严重的副作用，如记忆力减退、精神失常、共济失调等，故NMDAR和nNOS抑制剂类镇痛药物在临床上的使用受到了严重的限制[5-6]。最近研究发现，如果不直接干预NMDAR或nNOS，选择性阻断NMDAR与PSD-95或者nNOS与PSD-95的相互作用，可以在不影响NMDAR和nNOS生理功能的前提下抑制神经病理性疼痛中NO的病理性释放，可能获得没有明显中枢神经系统副作用的安全有效的神经病理性疼痛的治疗药物。目前，不同类型的新型镇痛药正在开发之中，以PSD-95为靶点，设法抑制NMDAR与 PSD-95或者nNOS与PSD-95的相互作用来治疗疼痛无疑成为研究的热点。本文简要介绍NMDAR/PSD-95/nNOS复合物的结构及在疼痛发生机制中的作用，重点综述了通过阻断NMDAR/PSD-95或PSD-95/nNOS相互作用用于治疗病理性疼痛的研究进展。

1 NMDAR/PSD-95/nNOS结构及其疼痛信号通路传导

NMDA受体广泛分布于哺乳动物的脑内。NMDA受体的活化不仅会引起Ca2+的大量内流，而且还会调节活化下游的信号通道，例如nNOS的活化。通过NMDA受体活化nNOS需要支架蛋白PSD-95的介导，NMDAR、PSD-95和nNOS通过蛋白-蛋白相互作用形成NMDAR/PSD-95/nNOS信号大分子复合物而发挥作用。

1.1 NMDAR

谷氨酸受体家族可分为离子型受体(iGluR)和代谢型受体（mGluR），mGluR属于G蛋白偶联受体。根据通道结构、亚基组成与基因家族的不同，又可将离子型谷氨酸受体分成3类：NMDA受体、α-氨基羟甲基异恶唑丙酸受体（AMPAR）及红藻酸受体（KAR）。

NMDAR广泛存在于中枢神经系统，由 NR1、NR2（NR2a、NR2b、NR2c与NR2d）、NR3（NR3a、NR3b）三类亚基组成，一般认为NMDAR是由两个NR1亚单位和两个NR2亚单位构成的异四聚体。在表达NR3亚基的细胞中NR3亚基与NR1和NR2亚基组装在一起形成NR1/NR2/NR3的聚合体发挥生理功能[7-9]。NMDA受体通道的激活不仅需要谷氨酸（Glu）作用于NR2亚基，还需要协同激动剂甘氨酸（Gly）作用于NR1亚基[10]。当细胞膜处于静息电位时，NMDAR被Mg2+以电压依赖的方式阻断而失活，由AMPAR诱导的细胞膜的去极化作用可使这种作用解除，从而使NMDA受体激活，引起Ca2+的大量内流。以前有研究者认为，NMDAR过度活化引起Ca2+的大量内流是神经细胞产生兴奋性毒性的主要原因，但最近有研究表明，单独阻断Ca2+的大量内流不能抑制由NMDAR过度活化引起的神经细胞兴奋性毒性的产生[11]。这表明，NMDAR过度活化除引起Ca2+的大量内流外，还激活了其它的信号通路，例如由NMDAR/PSD-95/nNOS复合物介导的nNOS活化，这对神经细胞兴奋性毒性的发生产生重要作用[12]。

1.2 PSD-95

突触后致密物（PSD）是兴奋性突触后膜超级信号分子复合体，是突触信号传导的关键物质。根据分子量的不同，可以把PSD划分为四类：PSD-95、突触后致密蛋白93（PSD-93）、突触相关蛋白97（SAP-97）和突触相关蛋白102（SAP-102）。PSD-95是PSD区含量最丰富的蛋白之一，是膜相关的鸟苷酸激酶（MAGUK）家族的一员[13-14]。

PSD-95包含3个PDZ区 （PSD-95/DLG/ZO-1），一个SH3（Src homology 3）区和一个同源的鸟苷酸（GK）区。PDZ区是一个90个氨基酸残基长度的分子，最早发现于PSD-95、DLG（Discs large）和ZO-1（Zonula occludens 1），是PSD-95、DLG和ZO-1首字母的缩写，典型的PDZ结构域包括一个由6个β折叠片（βA-βF）和2个α螺旋（αA-αB）组成的标准肽连接凹槽。肽连接凹槽能够识别靶蛋白C末端的特定氨基酸残基序列[15]。NMDA受体亚基含有PDZ结构域的结合区域，其中NR2a-b、NR2c-d和NR1亚基的碳末端分别包含有-ESDV-、-ESEV-和-STVV-氨基酸残基序列，这些序列能与PSD-95的PDZ1或PDZ2亚基结合，但不能与PDZ3结合[16]。

1.3 nNOS

nNOS由 1434个氨基酸残基组成，相对分子质量为160.8 kD。由于mRNA剪接的不同，目前已知的nNOS剪接体有超过10种。主要有nNOS-α（即nNOS-1）、nNOS-β、nNOS-γ、nNOS-μ、nNOS-2、nNOS-4、nNOS-5和TnNOS等[17]。其中nNOS-α即nNOS的全长基因，在脑中具有最大的催化活性，主要位于质膜。

nNOS包含两个催化结构域，分别是C末端的还原结构域和N末端的氧化结构域。nNOS的N末端包含着两个不重叠的结合区：一个是由1～99个氨基酸残基组成的PDZ结构域，这个结构域参与形成活性nNOS二聚体，通过PDZ相互作用可将nNOS锚定于质膜或细胞溶质蛋白。另一个是由100～130个氨基酸残基组成的β-finger结构，含有一个特定的-ETTF-氨基酸残基序列，能结合其它蛋白的PDZ结构域[18-19]。PSD-95和 nNOS相互作用时，PSD-95的 PDZ2结构域不仅与nNOS的PDZ结构域形成PDZ-PDZ二聚体，同时与nNOS的β-finger结构特定-ETTF-氨基酸残基序列发生相互作用[20]。PSD-95通过PDZ结构域分别与NMDAR的NR2亚基和nNOS的PDZ结构域及β-finger结构相互作用，将NMDAR、PSD-95和nNOS组合成信号分子复合物，通过NMDA受体的激活从而有效的活化nNOS[21]。

2 NMDAR/PSD-95/nNOS复合物阻断剂与神经病理性疼痛

神经病理性疼痛是一种以自发痛、痛觉异常和痛觉过敏为主要特点的慢性疼痛疾病。神经病理性疼痛的治疗依然是临床上的一个难题。研究表明，由Glu过度激活NMDA受体介导的中枢敏化（Central sensitization）在痛敏的产生和维持方面起关键作用，Glu通过激活NMDA受体不仅可以引起Ca2+的大量内流，而且可以通过NMDAR/PSD-95/nNOS复合物激活下游的nNOS，引发神经兴奋性损伤从而导致神经病理性疼痛（见图1）。实验表明，NMDA受体和nNOS抑制剂能有效缓解神经病理性疼痛[22-25]，但同时也伴随着记忆力减退、精神失常、共济失调等严重的中枢神经系统副作用。PSD-95通过PDZ结构域与NMDAR的NR2亚基结合，同时也可以与nNOS的β-finger结构发生相互作用，从而激活nNOS。研究发现，如果不直接抑制NMDAR或nNOS，选择性阻断NM-DAR与PSD-95或者nNOS与PSD-95的相互作用，可以在不影响NMDAR和nNOS生理功能的前提下抑制神经病理性疼痛中NO的病理性释放，可能获得没有明显中枢神经系统副作用的安全有效的神经病理性疼痛的治疗药物。

图1 NMDAR/PSD-95/nNOS复合物信号通路

Tat-PSD-95 PDZ2是一种包含PSD-95第二个PDZ结构域的重组多肽，该多肽能有效阻断NMDA受体与PSD-95相互作用。在体实验表明，Tat-PSD-95 PDZ2能有效抑制弗氏佐剂诱导的慢性炎症疼痛[26]。环状多肽CN2097同样也能与PSD-95的PDZ结构域结合，能干扰与中枢敏化相关的脊髓背角神经元的生理现象。

在慢性坐骨神经缩窄损伤 （CCI）神经病理性疼痛模型中，鞘内注射CN2097能有效抑制热敏性疼痛。另外，鞘内注射 CN2097能逆转神经病理性疼痛大鼠脊髓背角黑质中WDR神经元的过度兴奋[27]。Tat-NR2B9C是另一种NMDAR/ PSD-95阻断剂，它包含有NR2B碳末端的-KLSSIESDV-氨基酸序列，通过与PSD-95结合从而干扰NMDAR/PSD-95的相互作用。

实验表明，Tat-NR2B9C能够抑制感觉神经元的Windup现象。在脊神经结扎（SNL）病理性疼痛模型中，鞘内注射Tat-NR2B9C能有效抑制机械性痛敏和冷敏性疼痛，而且鞘内注射Tat-NR2B9C对正常的运动功能没有影响[28]。

近年来，有研究者认为，阻断处于信号传导下游的PSD-95/nNOS要优于阻断NMDAR/PSD-95。Tat-nNOS1-299是一种PSD-95/nNOS阻断剂，它包含有nNOS的N末端PDZ结构域和β-finger氨基酸片段。能够抑制PSD-95的PDZ2结构域与nNOS的PDZ结构域相互作用，进而阻断PSD-95/nNOS而不影响NMDAR的功能。实验表明，鞘内注射Tat-nNOS1-299能够抑制NMDA诱导的热敏性疼痛。在慢性坐骨神经缩窄损伤（CCI）神经病理性疼痛模型中，鞘内注射Tat-nNOS1-299能够有效缓解机械性异常疼痛[29]。

虽然重组多肽是一个很好的研究蛋白-蛋白相互作用的工具，同时也表现出了很好的镇痛效果，但是多肽的不稳定性和较差的药代动力学性质限制着它的进一步使用[30]。

IC87201是一种小分子的PSD-95/nNOS阻断剂，该小分子能够与nNOS的β-finger结构结合，进而抑制PSD-95与nNOS的相互作用。实验表明，IC87201干扰PSD-95与nNOS相互作用的IC50值为31 μmol·L-1。在NMDA诱导的热敏性疼痛小鼠模型中，鞘内注射剂量为1 pmol的IC87201能有效抑制热敏性疼痛。在慢性坐骨神经缩窄损伤（CCI）神经病理性疼痛模型中，鞘内注射IC87201能够有效缓解机械性异常疼痛，而且没有产生镇定、运动缺陷等中枢神经系统副作用。另外，对IC87201的药代动力学性质进行了检测，结果显示IC87201能很好地透过血脑屏障[29]。

ZL006是另一个小分子的 PSD-95/nNOS阻断剂，是IC87201的结构修饰物。ZL006的IC50值比IC87201低。研究显示，ZL006能够抑制大脑皮层神经元中NMDAR介导的NO合成，其IC50值为82 nmol·L-1，而且全身给药后能通过血脑屏障。ZL006能结合nNOS的β-finger，进而抑制PSD-95/ nNOS的偶联。在脑卒中模型MCAO中已经体现了良好的神经保护作用，再灌注后1 h给与ZL006（1.5 mg·kg-1，iv）能有效改善行为学评分和脑梗面积，另外，ZL006对nNOS的催化活性和NMDAR的功能没有抑制作用，也没有产生明显的中枢神经系统副作用[31]。NMDAR/PSD-95/nNOS复合物阻断剂及其特点见表1。

表1 NMDAR/PSD-95/nNOS复合物阻断剂及其特点

3 展 望

现有研究证实，NMDA受体介导的中枢敏化是病理性神经痛的主要发病机制。PSD-95是一种重要的调节蛋白，它将NMDA受体信号传递给细胞内蛋白和酶，如nNOS。大量实验表明，NMDA受体抑制剂和nNOS抑制剂能有效缓解神经病理性疼痛，但是同时也会影响NMDA受体和nNOS的正常生理功能，伴随着严重的中枢神经系统副作用。研究发现，如果不直接抑制NMDAR或nNOS，选择性阻断NMDAR与PSD-95或者nNOS与PSD-95的相互作用，能获得没有CNS副作用的镇痛药。如 NMDAR/PSD-95阻断剂 Tat-PSD-95 PDZ2、环状多肽CN2097、Tat-NR2B9C和PSD-95/nNOS阻断剂Tat-nNOS1-299、IC87201、ZL006。另外，与多肽类阻断剂相比，小分子阻断剂IC87201和ZL006具有更加良好的药物代谢动力学性质。PSD-95/nNOS阻断剂IC87201和ZL006因其低的IC50值、良好的药代动力学性质和良好的安全性将成为治疗病理性神经痛的先导化合物。因此，NMDAR/PSD-95或nNOS/PSD-95选择性阻断剂，特别是小分子阻断剂，将成为研究治疗神经病理性疼痛药物的热门方向。

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Research Progress of NMDAR/PSD-95/nNOS Complex in Neuropathic Pain

LIU Cheng-quan1,YAN Tian-hua1*,CHEN Rong2
1Department of Physiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Jiangsu Simovay Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nan-jing 210042

Neuropathic pain is a common chronic pain disease,with complex pathogenesis and inefficient clinical treatment.Recent studies have shown that N-methyl-D-aspartic acid receptor/postsynaptic density protein 95/neuronal nitric oxide synthase(NMDAR/PSD-95/nNOS)complex plays an important role in neuropathic pain.Studies found that it may obtain safe and effective drug for treatment of neuropathic pain with no obvious side effects,if a drug do not inhibit the NMDAR or nNOS directly but selectively disrupt the interaction of NMDAR/PSD-95 or PSD-95/nNOS,which can reduce the release of NO in neuropathic pain without affecting the NMDAR and nNOS functions.Therefore,the research progresses of NMDAR/ PSD-95/nNOS complex in neuropathic pain are summarized in this paper.

Neuropathic pain;NMDAR;PSD-95;nNOS

R971+.1

A

1673-7806（2015）02-168-04

刘成全，男，硕士生，研究方向：心脑血管及神经药理学E-mail:liuchengquan8@163.com

*通讯作者颜天华，男，副教授，硕士生导师，研究方向：心脑血管药理学E-mail:13016931191@126.com

2014-12-17

2015-01-15