地衣芽孢杆菌治疗肝硬化患者的临床药效评价*

高 璐，于 锋，王 坚**

1东南大学附属第二医院临床药学室，南京 210003；2中国药科大学临床药学教研室，南京 210009

地衣芽孢杆菌治疗肝硬化患者的临床药效评价*

高 璐1，于 锋2**，王 坚1**

1东南大学附属第二医院临床药学室，南京 210003；2中国药科大学临床药学教研室，南京 210009

目的：评价肝硬化患者肠黏膜屏障功能、血氨和血内毒素的变化特点及地衣芽孢杆菌胶囊对肝硬化患者的影响。方法：选择60例肝硬化患者进行随机开放性对照试验，使用随机数字表法分为治疗组和对照组，给予保肝、利尿、支持治疗，治疗组在此基础上加用地衣芽孢杆菌胶囊（整肠生）治疗两周。比较两组治疗前后血二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-L）、内毒素（ETX）、氨及肝功能变化情况。结果：肝硬化患者血DAO、D-L、ETX、氨四项指标与标准参考值相比增高，并且都随肝硬化Child-Pugh评分升高而升高（0.4＜r＜0.7，t＜0.01）。酒精与嗜肝病毒导致的肝硬化相比，前者DAO、D-L水平显著升高（P＜0.01）。14天的治疗观察后复查两组肝功能无明显差异，然而治疗组DAO、D-L、EXT、氨较治疗前都显著下降（P＜0.01）。治疗组停用整肠生后第14天复查总胆红素、DAO、D-L水平较停药前均无显著性差异（P＞0.05）。在14天的观察期内，治疗组与对照组并发症发生率差异无统计学意义（13.3%vs 3.3%，P＞0.0.5）。结论：地衣芽孢杆菌短期内治疗具有潜在保护肝硬化患者肠黏膜屏障的作用，从而降低循环血中的内毒素和氨水平。

地衣芽孢杆菌；益生菌；肝硬化；肠黏膜通透性；内毒素；氨

已知肠道菌群失调与肝功能损伤有明显的相关性，肝硬化时并发门静脉高压、低蛋白血症、肠黏膜淤血及水肿，导致肠道细菌过度生长，发生肠道细菌及毒素经过受损的肠黏膜进入血循环，造成肝脏进一步损伤，并引起一系列的并发症[1]，此在临床治疗中是一个难题。临床药师参考了有关文献并结合我院情况，应用地衣芽孢杆菌制剂防治肝硬化患者肠黏膜受损、内毒素血症、高血氨症及肝硬化并发症，并对患者肠黏膜功能、血内毒素、血氨与肝硬化程度及肝硬化病因之间的关系进行了研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月至2014年10月在我院肝病内科住院的肝硬化患者60例，其依据为：参考中华医学会肝病学会分别于2010和2004年制定的《乙型肝炎防治指南》[2]和《丙型肝炎防治指南》[3]中肝炎后肝硬化的诊断标准，以及2010年中华医学会肝病学会制定的《酒精性肝病诊疗指南》[4]中酒精性肝硬化的诊断标准确认为肝硬化患者，酒精性肝硬化患者均已戒酒半年以上，经B超或CT检查证实，临床症状和体征典型。

排除可能引起胃肠屏障功能损伤的肝外疾病（如糖尿病、甲状腺疾病、硬皮病和假性肠梗阻等）、合并肝外疾病所致的慢性腹泻、脑病、任何情况导致的感染及其他重要器官衰竭的患者；治疗前14天内均未用抗生素、微生态制剂、抑酸药、促胃肠动力药物和熊去氧胆酸制剂。共计男性42名，女性18名，年龄32～79岁。使用分层随机化法，先按由英国R.N.H.Pugh等人于1973年提出的肝硬化Child-Pugh（CP）分级方案进行评分并分为A、B、C三级，分别有16、22、22人；再根据随机数字表法分别随机将这三组肝硬化患者分为治疗组、对照组，各30例；两组患者的性别、年龄、血清总胆红素、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶、凝血酶原时间及CP评分无统计学差异（P＞0.05)，具有组间可比性，见表1。

1.2 治疗方法

治疗在尊重患者的知情权及自愿参与原则下实施。对照组给予常规保肝、利尿、营养支持的综合治疗；治疗组在此基础上加用口服地衣芽胞杆菌活菌胶囊（商品名：整肠生，东北制药集团公司沈阳第一制药厂提供，规格0.5 g，每粒含2.5亿活菌），每日3次，每次2粒，连服14天；治疗期间不使用抗菌药物及其他影响肠道菌群的制剂。

表1 两组患者一般资料比较（±s，n=30）

表1 两组患者一般资料比较（±s，n=30）

整肠生干预组阴性对照组P值年龄52.80±10.85 54.83±10.55 0.46性别（M/F）21/9 21/9 1.00酒精4 7病因乙肝病毒22 19 0.60丙肝病毒4 4 Child-Pugh分级（A/B/C）8/11/11 8/11/11 1.00 Child-Pugh评分8.73±2.38 8.83±2.48 0.87血清总胆红素（3～19 μmol·L-1）59.56±59.84 58.81±52.47 0.96谷丙转氨酶（5～40 U·L-1）52.41±42.13 67.03±76.85 0.37血清白蛋白（35～55 g·L-1）31.03±6.63 32.86±6.73 0.29凝血酶原时间（10～14 s）16.18±2.96 16.64±3.48 0.60

1.3 观察内容及方法

服药后每天记录临床症状：腹泻、便秘等，分别在第0、14天取肘部静脉血测定患者血氨、二胺氧化酶 （DAO）、D-乳酸盐 （D-L）的水平及血浆内毒素（ETX）水平，并进行肝功能检测。此外，治疗组在服用整肠生第14天后停药，停药后即刻抽血复测肝功能、DAO、D-L。使用日立全自动生化分析仪7600型检测常规生化功能；使用浙江伊利康生物技术有限公司的血氨检测试剂盒测定血氨；厦门鲎试剂实验厂有限公司的改良偶氮机制显色试剂盒检测ETX；上海广锐生物科技有限公司的双夹心ELISA试剂盒检测DAO及D-L。正常参考值：DAO 2.04U·mL-1、D-L 0.82 μg· mL-1[5]、ETX 1.75 EU·mL-1[6]、血氨18～79 mmol·L-1。

1.4 统计学处理

应用SPSS17.0软件系统进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，经正态性检验后，两组间差异采用单因素方差分析，同时进行Levene方差齐性检验，方差齐性资料采用F检验，两组间差异采用LSD法比较，方差不齐资料采用近似F检验Welch法，并且两组间采用Dunnett’s T3比较，相关性分析通过计算Pearson相关系数，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。血EXT、DAO、D-L采用回归及相关分析。

2 结 果

2.1 Child-Pugh分级A、B、C组之间比较

CP-C组患者四项指标均比CP-A组显著升高（P＜0.01），CP-C组的ETX、氨比CP-B组升高 （P＜ 0.05），其他指标未见显著性差异，见表2。

表2 不同Child-Pugh评分患者的DAO、D-L、ETX及血氨活性比较（±s）

表2 不同Child-Pugh评分患者的DAO、D-L、ETX及血氨活性比较（±s）

注：与CP-A组比较**P＜0.01；与CP-B组比较#P＜0.05。

项 目Child-Pugh分级A B C例数16 22 22 DAO（U·mL-1）9.77±4.80 17.58±13.51 24.43±19.34**D-L（μg·mL-1）0.91±0.52 1.45±1.16 1.89±0.93**ETX（EU·mL-1）4.32±4.41 5.21±2.78 7.96±3.57**#氨（mmol·L-1）33.35±21.73 41.32±12.32 53.10±17.90**#

通过计算Pearson简单相关系数分析CP评分与各项指标之间的线性相关性，反映出CP评分与DAO、D-L、EXT、氨均呈中等程度的正线性相关（0.4＜r＜0.7），而且显著水平均较高（t＜0.01），见表3。

表3 肝硬化评分与DAO、D-L、EXT、氨活性之间的Pearson相关分析

2.2 肝硬化病因之间比较

酒精性肝硬化组DAO、D-L、氨均高于肝炎肝硬化组（P＜0.01或P＜0.05），而两组的CP评分、EXT水平差异无统计学意义，见表4。

表4 肝炎肝硬化和酒精性肝硬化DAO、D-L、ETX和血氨的活性比较（±s）

表4 肝炎肝硬化和酒精性肝硬化DAO、D-L、ETX和血氨的活性比较（±s）

项目肝硬化病因嗜肝病毒酒精P值例数49 11 Child-Pugh评分9.64±2.80 8.59±2.30 0.20 DAO（U·mL-1）12.93±5.56 40.63±23.79＜0.01 D-L（μg·mL-1）1.14±0.44 2.91±1.48＜0.01 ETX（EU·mL-1）5.77±3.80 6.90±3.98 0.38氨（mmol·L-1）42.76±18.06 57.86±21.09 0.02

2.3 治疗组与对照组比较

治疗前两组患者各项指标均无明显差异，地衣芽孢杆菌治疗组前后比较：DAO、D-L、EXT、氨水平的差异有统计学意义；治疗组与对照组治疗后的D-L、ETX、氨之间均有统计学差异，对照组前后对比ETX活性有明显升高。见表5。

2.4 治疗组停药前与停药14天后比较

治疗组停用整肠生第14天复查总胆红素水平及肠黏膜屏障完整性指标，经配对样本t检验：TBil [（47.2±41.3）vs（39.4±27.0）μmol·L-1，P=0.06]、DAO [（14.2±11.1）vs （14.2±11.5）U·mL-1，P=0.93]、D-L [（1.0±0.5 vs 1.0±0.5）μg·mL-1，P=0.41]，停药前后各项指标均无显著性差异（P＞0.05）。

表5 两组患者检验方面改善比较（±s，n=30）

表5 两组患者检验方面改善比较（±s，n=30）

注：与同组治疗前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

组别总胆红素（μmol·L-1）白蛋白（g·L-1）丙氨酸氨基转移酶（U·L-1）DAO（U·mL-1）D-L（μg·mL-1）ETX（EU·mL-1）氨（mmol·L-1）治疗组治疗前59.6±59.8 31.03±6.63 52.4±42.1 17.0±13.3 1.4±0.9 6.6±4.1a45.3±21.5治疗后47.2±41.3 31.27±5.33 36.0±19.3*14.2±11.1**1.0±0.5**#3.9±3.7**##32.2±17.6**##对照组治疗前58.8±52.5 32.86±6.73 67.0±76.9 19.0±17.5 1.5±1.1 5.4±3.5 45.8±17.3治疗后56.0±55.9 32.77±6.77 35.0±22.0*18.1±14.7 1.5±1.0 6.8±3.7**42.5±13.2

2.5 治疗组与对照组并发症发生情况比较

在14天的观察期内，对照组出现轻微型肝性脑病（minimal hepatic encephalopathy，MHE）2例，原发性腹膜炎2例，并发症发生率为13.3%（4/30）；治疗组仅出现MHE 1例，并发症发生率为3.3%（1/30）；两组的并发症发生率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 不良反应

治疗组中有1例男性患者在第一次服用整肠生后出现腹泻，之后服药未再出现腹泻现象，无一例因不良反应而终止治疗。

3 讨 论

肝脏与肠道在解剖和功能上存在广泛而密切的联系，构成“肠肝轴”，所以肠道菌群失衡参与肝硬化各种并发症的发生发展。由于门脉高压症，肝硬化患者的肠道黏膜长期处于瘀血、缺氧状态，肠黏膜屏障被破坏，再加之肠肝循环紊乱导致肠道致病菌过度生长和机体免疫功能低下，肝硬化患者极易发生肠道细菌移位 （bacterial translocation，BT），即肠道细菌或其产物（EXT）透过肠壁进入肠系膜淋巴结，继而进入机体循环。BT除了直接导致细菌感染发生之外，还会激发全身性炎症反应，影响机体血流状态，诱发肝性脑病等并发症的发生发展。血中二胺氧化酶和D-乳酸活性均可作为监测肠黏膜损害和其通透性改变的早期指标。内毒素由肠道革兰阴性菌产生，体积小于细菌，当肠黏膜通透性增加时即可通过受损的黏膜经门静脉进入肝脏或周边淋巴组织而引起全身的炎症反应，进一步加重肝损伤，形成恶性循环。氨的主要来源是肠道，在肠道细菌尿素酶作用下产生，经肝脏解毒，肝硬化时解毒功能受损，血液中氨水平升高，血氨的变化可反映肠道的功能状态，另外高浓度血氨在肝硬化所致的肝性脑病的发生中起着重要作用。

益生菌是一类活菌制剂，有平衡肠道菌群、抑制潜在致病菌、增加肠黏膜抵抗力的作用，可在多个水平下调内源性炎症介质，近几年被越来越多地用于肝硬化的辅助治疗。一项Meta分析[7]显示，通过补充益生菌制剂可以改善肝硬化患者的临床症状，并降低并发症的风险。目前临床常用的益生菌中，很多菌种如双歧杆菌、乳杆菌和粪肠球菌等，必须低温冷藏保存，以使菌体休眠才能最大限度保持活性益生菌的数量，而地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的菌株耐高温能力强，所以常温保存即可，并能以芽孢形式通过高胃酸环境，到达肠道后芽孢萌发成活菌，发挥最佳功效。地衣芽孢杆菌的作用机制包括拮抗、夺氧、屏障、免疫、营养五个方面，能有效抑制肠道致病菌生长和对肠上皮细胞的粘附作用[8]。综上，为了保证患者服药依从性及用药效果，临床药师在综合治疗的基础上，选用地衣芽孢杆菌胶囊制剂（整肠生）治疗肝硬化患者。

研究表明，与正常参考值相比，肝硬化患者血DAO、D-L、ETX及血氨水平明显增高，并且均随肝硬化Child-Pugh评分升高而升高，表现为中度正相关性。Child-Pugh分级代表肝脏损害的严重程度，评分越高肝脏损害越严重，肝脏处理毒素、病原微生物的能力越低。CP-C级患者不仅有肠通透性的增加，还存在小肠细菌过度繁殖，这可能是这四项指标达到高峰的原因。失代偿期肝硬化患者极易出现肠黏膜屏障功能损伤，发生肠源性内毒素血症、高氨血症。纳入实验的49名肝炎肝硬化患者与11名酒精性肝硬化患者相比较，Child-Pugh评分无差异，说明两组的肝硬化程度相当。酒精性肝硬化患者DAO、D-L明显高于肝炎肝硬化患者 （P＜0.01），因为长期大量酒精摄入可导致肠道代谢下降，此外乙醇及其氧化产物乙醛均可破坏肠上皮的紧密连接[9]，进而诱导肠屏障通透性增加。整肠生治疗组在服药14天后血DAO、D-L、EXT、氨都显著下降，但总胆红素、白蛋白、谷丙转氨酶这三项反映肝功能的主要指标与治疗组相比无明显差异。说明短期内补充地衣芽孢杆菌具有潜在保护肝硬化患者肠黏膜屏障的功能，从而减少循环血中的内毒素和氨，但在改善肝功能方面没有明显作用，因为肠道菌群失调仅是肝硬化发展的病因之一。另外，发现治疗组在停药14天后肠道通透性仍能保持停服整肠生之前的较好状态，提示该药物能有效地改善肝硬化患者肠屏障功能，疗效较持久。整肠生可以明显降低肝硬化患者血氨、内毒素水平，故治疗组肝性脑病、原发性腹膜炎的发生率低于对照组，但无显著性差异，具体原因尚须进一步分析。整肠生干预组中未发生严重不良反应，故推测临床中应用整肠生辅助治疗肝硬化安全性较好，但临床须加大样本量进一步研究证实其安全性。

综上所述，整肠生具有不易失活、价廉、安全等优点，可以用于治疗肝硬化、尤其是失代偿期肝硬化，对酒精性肝硬化患者也有较高的应用价值，对维护肠道微生态平衡、改善肠黏膜屏障功能和预防肝硬化并发症的发生发展有积极作用，且停药后也能维持较长时间的疗效；但是，本研究规模较小，今后需进行较大规模的临床干预研究。关于整肠生的药代动力学系统描述、使用时机、安全性、与抗生素联用等问题都将有待于深入的研究，为临床使用提供指导。

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Clinical Evaluation of Bacillus Licheniformis in the Treatment of Liver Cirrhosis*

GAO Lu1,YU Feng2**,WANG Jian1**
1The Second Hospital of Nanjing Affiliated to Southeast University,Nanjing 210003;2Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:To investigate the function of intestinal mucosal barrier in patients with liver cir-rhosis(LC)and explore the clinical efficacy and safety of Bacillus licheniformis in the treatment of LC pa-tients.Methods:In a randomized open study,60 participants with LC,in accordance with the random number table,were divided into experimental group and control group.Patients in the control group re-ceived hepatoprotective,diuretic and supporting treatment,and patients in the experimental group were giv-en probiotic capsules containing Bacillus licheniformis(Zhengchangsheng capsules)besides the same general therapy for a period of 14 days.The changes of DAO,D-L,EXT and ammonia levels and liver function before or after treatment between the 2 groups were compared．Results:The levels of DAO,D-L,EXT and ammonia were higher in patients with LC than the reference values.The levels were also positively correlated with the Child-Pugh scores.The levels of DAO and D-L were significantly higher with alcoholic cirrhosis than with liver cirrhosis of hepatitis (P＜0.01).Our study did not show a significant beneficial ef-fect of probiotic supplementation to improve liver function in patients with LC.Nevertheless,the adminis-tration of probiotics appeared to significantly reduce the DAO,D-L,ETX and ammonia levels starting after 14 days of treatment(P＜0.01).Up to 14-day after probiotics withdrawal,total bilirubin,DAO and D-L did not rebound.There was no statistical difference in the incidence of complications between the 2 groups (13.3%vs 3.3%,P＞0.05).Conclusions:Bacillus licheniformis could improve the function of intestinal mu-cosal barrier,reduce the absorption of enterological EXT and ammonia.

Bacillus licheniformis;Probiotics;Liver cirrhosis;Intestinal permeability;Endotoxin;Ammonia

R969.4；R657.3+1

A

1673-7806（2015）02-127-04

江苏省药学会奥赛康临床药学科研项目（No.201010）

高璐，女，硕士生 E-mail:gaolu08@126.com

* *通讯作者于锋，男，教授 E-mail:yufengcpu@163.com王坚，男，主任药师 E-mail:wangjian990@sina.com

2015-01-12

2015-02-08