饥饿及复投喂对大黄鱼肌肉生长抑制素1型和2型基因表达的影响

韩明星 薛良义

(宁波大学海洋学院, 浙江海洋高效健康养殖协同创新中心, 宁波 315211)

饥饿及复投喂对大黄鱼肌肉生长抑制素1型和2型基因表达的影响

韩明星 薛良义

(宁波大学海洋学院, 浙江海洋高效健康养殖协同创新中心, 宁波 315211)

采用荧光实时定量 PCR技术研究饥饿及复投喂对大黄鱼不同组织中两型肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因表达的影响。结果显示, 肌肉中MSTN-1和MSTN-2在饥饿0—35d期间, 表达量先升高后降低, 分别在21d和28d达到最高, 复投喂时期逐渐下降; 脑中两型MSTN表达变化不同, 但都在饥饿35d表达量最低, 复投喂时期表达显著上升, 与对照组有显著差异; 脾脏中MSTN-1在饥饿28d表达量最高, MSTN-2在饥饿21d表达量最高, 复投喂时期表达都逐渐降低; 肾脏中两型MSTN表达变化相似, 都在饥饿21d降到最低,然后升高; 肠中1型和2型分别在饥饿14d和7d表达量最低, 在28d表达量都达到最高; 肝脏中两型MSTN都是在饥饿21d表达量最低, 之后显著升高, 复投喂时期表达上升。结果提示两型MSTN在不同组织中的功能可能存在差异。

大黄鱼; 肌肉生长抑制素基因; 荧光实时定量PCR; 饥饿; 复投喂

1997年, McPherron等[1]在小鼠(Mus musculus)骨骼肌中发现TGF-β超家族(Transforming growth factor-β superfamily, TGF-β)成员肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN), 又称生长分化因子8(Growth and differentiation factor-8, GDF-8), 具有抑制肌肉细胞增殖和分化的功能, 敲除该基因的小鼠, 骨骼肌重量明显增加。在MSTN过表达的转基因小鼠中, 肌肉量明显降低[2]。比利时兰牛(Bos taurus)由于MSTN基因突变, 出现“双肌”表型[3]。近年来, 陆续在人(Homo sapiens)[4]、狗(Canis lupus familiaris)[5, 6]、羊(Ovis aries)[7]体内发现由于MSTN基因突变而导致肌肉肥大的现象, 而且很多的研究表明MSTN在鱼类肌肉增殖和分化过程中也起着十分重要的作用[8—10]。

哺乳动物的 MSTN主要在骨骼肌中表达[1], 在乳腺[11]、心脏[12]等组织中的表达量很低。与哺乳动物不同, 某些鱼类存在两种类型的 MSTN, 且表达范围更加广泛, 如斑马鱼(Danio rerio)[13]、金鲷(Sparus aurata)[14, 15]等鱼类中存在 MSTN-1和MSTN-2, MSTN-1在肌肉、脑、肠、心脏、肝脏等组织中广泛表达, MSTN-2的表达则有一定的特异性,但普遍在脑中高度表达[14—16]。

在自然环境中, 由于环境变化或者食物分布不均等, 鱼类经常会受到高、低温, 或者饥饿等环境因素的影响, 进而影响其生理机能。研究表明 MSTN的表达也会受环境的影响, 低温和养殖密度的增大分别可以使鲶(Ictalurus punctatus)[17]和斑马鱼[18]中MSTN-1的表达发生变化, 而饥饿会影响金鲷[19]、黑鲈(Dicentrarchus labrax)[20]和尖吻鲈(Lates calcarifes)[21]等鱼类中MSTN的表达。

大黄鱼是我国主要的海水养殖鱼类之一, 具有较高的经济价值。在越冬养殖期间, 很长一段时间停止喂食, 但禁食对大黄鱼生理机能影响的研究报道很少。本文在已克隆到大黄鱼MSTN-1(AY842933) 和 MSTN-2(EU571244)基因的基础上, 研究不同饥饿时段及复投喂对大黄鱼肌肉、脑、脾、肾、肠、肝脏等6个组织中两型MSTN基因表达的影响, 初步探讨了两型MSTN基因在不同组织中的表达变化,为研究两型基因的功能差异提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

100尾大黄鱼购自宁波海湾水产苗种繁育中心,体重(111.51±6.24) g, 暂养于网箱(3 m×3 m×3 m)中,投喂冰鲜鱼, 每天在早上5点和下午5点各1次。达到饱食状态后不再投喂, 暂养一周后, 进行分组,随机选取40条作为对照组。实验期间对照组正常投喂, 实验组不投喂, 取样时间为饥饿1d、7d、14d、21d、28d、35d、复投喂7d和14d, 饥饿0d从对照组中取样, 复投喂在饥饿 35d后进行。前三次取样均取对照组, 将其与饥饿0d相比, 表达量无显著差异, 故用饥饿0d的表达水平来代表对照组。实验从10月持续到11月, 水温 (20—23)℃, 每次取样时从中随机取3尾, 每尾鱼取其肌肉、脑(整个脑组织)、脾、肾、肠和肝组织, 装于1.5 mL离心管(RNasefree),迅速置于液氮中, 后转至–80℃保存备用。

1.2 方法

总RNA的提取 从–80℃超低温冰箱中取出大黄鱼组织样品, 采用上海生工生物工程有限公司的Trizol试剂, 按照说明书提取各组织总RNA, 提取的总 RNA经 Dnase Ⅰ(宝生物工程(大连)有限公司)处理去除 DNA污染, 之后采用 1%琼脂糖凝胶(上海生工生物工程技术服务有限公司)电泳检测总RNA完整性, 并用NanoDrop超微量紫外分光光度计(美国托摩根科技有限公司)测定总RNA浓度。

反转录合成 cDNA 根据 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书建立反转录体系, 参照薛良义等[22]方法进行反转录。

引物设计 根据本实验室克隆到的 MSTN-1 (AY842933)和MSTN-2(EU571244)序列, 设计MSTN-1的引物 My1F 5′-TCCCTGAAGATCGACGTGAA-3′和My1R 5′-TTTGGGGCAATAATCCAGTC-3′; MSTN-2的引物My2F 5′-CCATAGTATCAAGTCCCAGATC C-3′和My2R5′-TGAACAGGCAGCAGGAGGACAA C-3′; 内参β-actin引物βactinF 5′-CCAGATCATGTT CGAGACCTTC-3′和βactinR 5′-GAACCTCTCATTG CCAATGGTG-3′, 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

饥饿及复投喂时期MSTN-1和MSTN-2在不同组织中的表达检测 每个时期每个样品重复3次,采用 qPCR, 反应在 Eppendorf Mastercycler®eprealplex 实时荧光定量 PCR仪中进行, 体系为: SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2×)(宝生物工程(大连)有限公司)12.5 μL, PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.5 μL, PCR Reverse Primer (10 μmol/L)0.5 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 10.5 μL, Total Volume 25 μL, 两步法进行扩增, 并且增加熔解曲线以验证反应的特异性, 反应程序为95℃预变性1min, 95℃变性40s, 58℃退火40s, 40个循环, 熔解曲线(55—95)℃。此外, 还检测了目的基因和内参的扩增效率, 内参基因的扩增效率为 101.2%, MSTN-1的扩增效率为100.2%, MSTN-2的扩增效率为100.3%, 基因扩增效率都接近100%。

数据分析 对目的基因和内参基因进行扩增效率一致性检测, 结果表明目的基因和内参基因扩增效率相同, 且都接近100%, 故实验得到的Ct值用2–∆∆Ct法进行分析, 数据以平均值±标准差形式表示(Mean±SD; n=3), 不同处理组数据用单因素方差分析进行显著性检验, 当 P＜0.05时差异显著, P＜0.01时差异极显著。

2 结果

2.1 大黄鱼不同组织中两型 MSTN基因的表达差异

在实验开始时, 对大黄鱼不同组织中 MSTN-1 和 MSTN-2的表达进行检测, 在大黄鱼肌肉、脑、脾脏、肾脏、肠和肝脏等6种组织中, MSTN-1在肌肉和脑中表达最高, MSTN-2在脑中表达最高。在肌肉和脾脏中MSTN-1的表达高于MSTN-2, 特别是肌肉中, 1型的表达量约为2型的200倍, 而在脑、肾脏、肠和肝脏组织中, MSTN-2高于MSTN-1的表达,其中脑组织中MSTN-2的表达量约为MSTN-1的5 倍(图1)。

2.2 饥饿及复投喂对大黄鱼肌肉 MSTN基因表达的影响

图1 大黄鱼MSTN-1和MSTN-2在不同组织中的表达Fig. 1 Tissue-specific expression of MSTN-1 and MSTN-2 in Larimichthys crocea

在饥饿处理阶段, MSTN-1的表达趋势是先升后降, 从饥饿处理开始到饥饿21d, 表达上升, 之后显著下降, 复投喂后, 其表达先升高后降低, 并在复投喂14d, 表达量最低; MSTN-2在饥饿开始阶段表达变化不大, 随着饥饿时间的延长, 其表达上升,并在饥饿 28d表达量最高, 复投喂后表达下降, 但仍显著高于对照组(图2)。

2.3 饥饿及复投喂对大黄鱼脑 MSTN基因表达的影响

在大黄鱼脑中, MSTN-1的表达在饥饿7d后显著下降, 并在饥饿 35d表达量最低, 复投喂时期表达显著升高; MSTN-2的表达变化与 MSTN-1不同,在饥饿过程中, 除饥饿 35d外其表达量基本均高于对照组, 复投喂时期表达显著升高(图3)。

2.4 饥饿及复投喂对大黄鱼脾脏和肾脏 MSTN基因表达的影响

在脾脏(图4)和肾脏(图5)中, MSTN-1在饥饿一段时间后表达都显著下降, 之后有所回升, 但脾脏在饥饿7d显著下降, 肾脏在饥饿21d显著下降, 在复投喂阶段, 两个组织中, 复投喂14d MSTN-1的表达量都低于复投喂7d。

在整个饥饿及复投喂阶段, MSTN-2在脾脏中的表达呈现的是先升后降的趋势, 饥饿 21d表达量达到最高, 而在肾脏中呈现的大致趋势是先降后升的,并且在饥饿21d表达量最低。

2.5 饥饿及复投喂对大黄鱼肠和肝脏 MSTN基因表达的影响

在肠(图6)和肝脏(图7)中, MSTN-1的表达在饥饿7d、28d和复投喂14d都有显著升高, 并在饥饿28d表达量达到最高, 在其他阶段都显著低于对照组, 在饥饿 35d的肝脏中未检测到其表达; 肠中MSTN-2在饥饿7d和21d表达量显著下降, 在肝脏中仅在饥饿 21d显著下降, 其他阶段表达量均显著高于对照组, 相对于1型, 在饥饿35d, 肝脏中2型的表达量相对较高。

图2 饥饿及复投喂对大黄鱼肌肉组织中MSTN-1(A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 2 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the muscles of Larimichthys crocea

图3 饥饿及复投喂对大黄鱼脑组织中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 3 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the brain of Larimichthys crocea

图4 饥饿及复投喂对大黄鱼脾脏组织中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 4 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the spleen of Larimichthys crocea

图5 饥饿及复投喂对大黄鱼肾组织中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 5 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the kidney of Larimichthys crocea

图6 饥饿及复投喂对大黄鱼肠组织中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 6 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the intestine of Larimichthys crocea

图7 饥饿及复投喂对大黄鱼肝脏组织中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表达的影响Fig. 7 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the liver of Larimichthys crocea

3 讨论

在哺乳动物中, MSTN的作用主要是抑制肌肉生长和发育[1], 由于基因组复制, 在部分硬骨鱼类中产生了两种类型的 MSTN, 且两者组织表达模式并不相同。我们在之前的研究中, 利用半定量 PCR技术, 发现大黄鱼MSTN-1主要在肌肉、脑、脾脏、肠等组织中表达, MSTN-2主要在脑中表达[22], 本文采用荧光实时定量PCR方法研究两种类型MSTN的表达, 1型在肌肉和脑中表达最高, 2型在脑中表达最高, 与之前报道中表达量较高的几个组织基本一致, 此外本文肠中 MSTN-1的表达量较低, 而之前研究中肠的表达量相对较高, 这种差异可能与不同的实验方法有关。在斑马鱼中, MSTN-1主要在白肌、脑、心脏等组织中表达, MSTN-2主要在脑、脾脏中表达[13]。在罗非鱼(Oreochromis mossambicus)[23]和金鲷[14, 15]中, MSTN-1主要在肌肉、脑和肠中表达, MSTN-2则主要在脑中表达。

饥饿处理之后进行复投喂, 鱼类进入补偿生长阶段, 在这个过程中, 鱼摄食增加, 体内进行大量的合成代谢, 生长速率加快。生长激素(Growth hormone, GH)、类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factors, IGFs)等与生长相关的基因参与调控, GH和IGFs可以促进蛋白质合成, 而MSTN是肌肉生长分化的负调控因子, 促进蛋白质的分解代谢[24]。两类功能不同的基因在应对饥饿压力时, 其表达变化也是不同的。研究发现, 大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)经饥饿处理后IGF-1的表达下降[25], 虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在饥饿处理后 IGF-1表达下降, 复投喂过程中IGF-1的表达上升[26, 27]。金鲷在饥饿初期, 肌肉中 MSTN-1的表达上升[32], 黑鲈在饥饿4周后, 白肌中MSTN-1表达上升, 复投喂后,表达下降[20]。本研究得到的结果与黑鲈的研究结果一致, 在大黄鱼肌肉中, MSTN-1在饥饿21d之前表达升高, 复投喂14d后表达显著下降, 而MSTN-2的表达也是在饥饿阶段表达上升, 复投喂阶段表达下降。我们已经通过转基因技术证实大黄鱼 MSTN-1可以调控肌肉生长[28], 在本研究中2型与1型在大黄鱼肌肉中表达变化趋势相似, 其功能是否与MSTN-1相似, 还有待研究。已有报道, 在斑马鱼中,过量表达 MSTN-2, 肌肉量下降, 出现肌肉萎缩[29],说明 MSTN-2也可能与肌肉生长调控相关。Santis 等[21]对尖吻鲈的研究显示, MSTN-1在饥饿处理后表达上升, 而2型表达未发生变化, 推测两型MSTN的表达变化的不同, 可能是由于 MSTN-2在启动子区域缺少糖皮质激素响应因子, 糖皮质激素可以通过和响应因子结合而上调MSTN的表达[30, 31]。在斑马鱼中, 饥饿上调MSTN的表达, 可以激活SMAD信号通路, SMAD蛋白复合体抑制MyoD的转录, 进而抑制肌肉的生长与发育[32]。在罗非鱼中, 饥饿3d导致MSTN-1的表达上升, 但9d后其表达下降[33], 对不同品系的斑马鱼进行饥饿处理, MSTN-1和MSTN-2的表达变化也不相同[34], 在鲶肌肉中MSTN-1的表达不受饥饿处理的影响[35]。

MSTN在脑中的功能目前还没有直接验证, 对小鼠脑中MSTN的表达进行研究, 发现MSTN在海马体和大脑皮层中都有表达, 在嗅觉区域, MSTN主要在嗅皮质区表达, 在嗅球及丘脑区则主要是生长分化因子-11(Growth and differentiation factor-11, GDF-11)广泛表达, 研究发现GDF-11对神经发生有一定作用[36], 而在多数鱼类脑中 MSTN-2都高度表达, 推测MSTN-2也与神经系统的发育有关。Santis 等[21]发现鲈在饥饿30d后, 脑中MSTN-1表达下调, 而 MSTN-2的表达相对较稳定, 认为两者表达变化的不同在于糖皮质激素对其的调节。在本研究中显示大黄鱼脑中 MSTN-1在饥饿初期表达升高, 之后显著下降, 并在饥饿35d时表达最低, MSTN-2在饥饿期间, 表达量基本都要高于对照组, 两者在饥饿处理期间表达变化不同, 这与鲈的研究结果不同,暗示大黄鱼脑组织中MSTN的表达可能受其他因素调控。

脾脏和肾脏是鱼类重要的免疫器官, 是淋巴细胞、巨噬细胞和颗粒细胞等增殖分化的主要场所, 鲀在免疫防御系统中有重要作用。红鳍东方 (Fugu rubripes)在饥饿压力下, 脾脏中淋巴细胞的增殖转化能力和巨噬细胞的吞噬能力增强, 但随着饥饿时间的延长, 增殖转化能力和吞噬能力下降[37]。且Harms等[38]研究发现, 美洲白鲈(Morone americana)脾脏TGF-β家族mRNA水平和头肾巨噬细胞的吞噬活力成反比。在本研究中, 大黄鱼脾脏中 MSTN-1和肾脏中的两型MSTN表达的大致趋势都是先下降后上升, 这种表达变化可能与其免疫细胞的能力变化有关, 而脾脏中 MSTN-2的表达变化与 MSTN-1不同, 呈现先上升后下降的趋势, 暗示两型 MSTN在脾脏中可能有不同的功能。

在饥饿条件下, 肝脏和肠最先受到影响, 主要和它们能够储存能源物质有关, 饥饿早期, 肝和肠就会出现萎缩, 对南方鲇仔鱼(Silurus meridionalis)的研究发现, 饥饿6d后, 肝细胞出现核仁解体现象[39]。在饥饿处理过程中, 由 TGFβ介导的细胞凋亡增加,并且抑制细胞增殖, 导致肝脏体积显著减小, 发生萎缩[40—43]。在本研究中, 饥饿初期, 肝脏中两型MSTN的表达都上升, 肝脏的体积也明显变小, 这与Santis等[21]对鲈的研究结果一致, 推测在肝脏中, MSTN可能参与了相关调控。

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EFFECTS OF FASTING AND REFEEDING ON THE EXPRESSION OF MSTN IN LARGE YELLOW CROAKER (LARIMICHTHYS CROCEA)

HAN Ming-Xing and XUE Liang-Yi
(Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-Efficiency and Healthy Aquaculture, College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, we used real-time PCR to investigate the effects of fasting and re-feeding on the expression of two MSTN genes in large yellow croaker (Larimichthys crocea). The results showed that during the 35-day fasting treatment, the expression of MSTN-1 and MSTN-2 in skeletal muscles firstly increased and then decreased, and their expressions perked on the 21st and the 28th day respectively. The expressions were down-regulated during the re-feeding period. The expression patterns of the two MSTNs were different in the brain, although they both reached the lowest level on the 35th day and then increased after re-feeding. In the spleen the expressions of MSTN-1 and MSTN-2 reached to the highest levels on the 28th and the 21st days respectively, and both declined after the re-feeding. In kidney the expression patterns of the two genes were similar, and they both reached the lowest on the 21st day after fasting followed by an increase. The expression of MSTN-1 and MSTN-2 in the intestine decreased significantly on the 14th and the 7th day respectively, and then peaked on the 28th day. In the liver, the expression of MSTN-1 and MSTN-2 decreased sharply on the 21st day and then increased. The expressions of both genes were up-regulated after re-feeding. Our findings suggested that the functions of the two MSTN genes might be various in different tissues.

Larimichthys crocea; Myostatin; Real-time PCR; Fasting; Re-feeding

S917.4

A

1000-3207(2015)04-0669-08

10.7541/2015.89

2014-07-18;

2015-01-06

国家自然科学基金(30871916,31172398); 浙江省自然科学基金(LY15C190005); 浙江省科技厅项目(2012C12907-8)资助

韩明星(1989—), 女, 河南焦作人; 硕士研究生; 研究方向为水产生物分子生物学。E-mail: hanmingxing100@163.com

薛良义, E-mail: xueliangyi@nbu.edu.cn