外周血β－HCG mRNA表达与妊娠滋养细胞肿瘤血行转移的相关研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 郑 芳

外周血β－HCG mRNA表达与妊娠滋养细胞肿瘤血行转移的相关研究

范思斯 潘 玫 秦海燕 郑 芳

目的研究妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达情况，评价其表达与不同临床指标的关系。方法收集28例妊娠滋养细胞肿瘤、15例葡萄胎、10例正常妊娠妇女和10例非妊娠妇女外周血。运用外周血密度梯度离心法提取单个核细胞和滋养细胞后采用RT－PCR方法检测四者β－HCG mRNA表达水平，并与妊娠滋养细胞肿瘤临床指标做相关分析。结果10例非妊娠妇女外周血β－HCG mRNA表达均阴性，10例正常妊娠妇女外周血中3例见β－HCG mRNA扩增条带，15例葡萄胎患者外周血中8例见β－HCG mRNA扩增条带，28例妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中24例见β－HCG mRNA扩增条带，正常妊娠妇女β－HCG mRNA表达水平低于葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤患者(P＜0．05)。妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与治疗前血β－HCG水平、肺转移及临床分期有关(P＜0．05)。28例随访病例中只有1例进展，无复发病例。结论外周血中单个核细胞不表达β－HCG mRNA。正常妊娠、葡萄胎及妊娠滋养细胞肿瘤均有滋养细胞脱落入血。外周血滋养细胞β－HCG mRNA可能成为评估妊娠滋养细胞肿瘤早期血行转移的有效指标。

妊娠滋养细胞肿瘤;β－HCG;密度梯度离心法;逆转录－聚合酶链反应

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:806～811)

本研究拟采用密度梯度离心和RT－PCR技术检测妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中β－HCG mRNA表达，评价其表达与不同临床指标的关系，寻找早期诊断妊娠滋养细胞肿瘤血行转移的标志物，以期合理治疗及预测预后。

1 材料与方法

1．1 一般资料

收集江西省妇幼保健院2013年4月－10月入院的28例初治侵蚀性葡萄胎或妊娠性绒毛膜癌，经血β－HCG检测、B超、胸片或病理学确诊;除外既往有乳腺癌、肺癌等上皮性癌病史者及非妊娠性绒毛膜癌者。患者年龄16～45岁，平均年龄27岁。前次妊娠葡萄胎16例，非葡萄胎12例。前次妊娠至确诊间隔时间为1～16个月。临床表现为阴道不规则出血20例，大出血2例，月经紊乱1例，下腹痛5例，咳嗽3例，恶心、呕吐4例，无症状仅表现为血β－HCG异常者3例。肺CT示大小不等(0．21～3．54 cm)结节影22例。治疗前血β－HCG(mIU/ml)＜1033例，≥103～10410例，＞104～10514例，＞1051例。解剖学分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期1例，Ⅲ期22例，Ⅳ期0例，改良FIGO预后评分低危21例，高危7例。28例侵蚀性葡萄胎或妊娠性绒毛膜癌患者中24例接受2～10个疗程化疗，平均疗程5个;1例仍在化疗中，1例因肺结核转院治疗，2例中途拒绝治疗。化疗方案:(1)单药氟尿苷;(2)双药FA:氟尿苷+更生霉素;(3)三药FAV:长春新碱+氟尿苷+更生霉素;(4)EMA－CO:甲氨蝶呤+依托泊苷+更生霉素/长春新碱+异环磷酰胺。24例患者综合治疗后21例(87．5%)获完全缓解，3例(12．5%)部分缓解(残留肺部病灶);6例耐药。另取15例葡萄胎患者、10例正常妊娠妇女及10例非妊娠妇女作为对照组。

1．2 试剂与引物设计

人外周血淋巴细胞分离液(FICOLL配制)，购自天津市灏洋生物制品科技有限公司。RNAiso plus、PrimeScriptTMRT－PCR Kit(RR014A)、50 bp DNA marker，购自大连宝生物公司。β－HCG和GAPDH mRNA引物，购自南京金斯瑞生物科技有限公司。β－HCG和内参基因GAPDH mRNA引物设计参考有关文献［1］，并经BLAST验证。β－HCG上游引物:TACTGCCCCACCATGACC，下游引物:CACGGCGTAGGAGACCAC;产物大小为144 bp。GAPDH上游引物:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物:AGGGGCCATCCACAGTCTTC;产物大小为258 bp。

1．3 标本采集与总RNA提取

采集化疗前侵蚀性葡萄胎或妊娠性绒毛膜癌患者、清宫前葡萄胎患者、正常孕2～3月妊娠妇女及非妊娠妇女EDTA抗凝血4 ml。淋巴细胞分离液分离单个核细胞和滋养细胞。RNAiso plus抽提细胞总RNA，具体操作按说明书进行。美国伯乐分光光度仪测OD260 nm/OD280 nm比值判断RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。

1．4 RT－PCR

合成cDNA第一链:①dNTP Mixture(10 mM each)1 μl，Oligo dT Primer(2．5 μM)和Random 6 mers (20 μM)各0．5 μl，模板RNA 1 μg，无核酶水补足10 μl;置恒温水浴锅65℃5 min，4℃。②上述反应液10 μl，5×PrimerScript Buffer 4 μl，RNase Inhibitor(40 u/μl)0．5 μl，PrimeScript RTase 0．5 μl，无核酶水，5 μl;共20 μl体系。置PCR仪30℃10 min，42℃15 min，95℃5 min，4℃。PCR反应:①10×PCR Buffer II 2 μl，dNTP Mixture(10 mM each)0．8 μl，上游引物0．2 μl，下游引物0．2 μl，Takara Ex Taq HS(5 u/μl) 0．2 μl，上述反转录反应液2 μl，无核酶水补足20 μl。②PCR反应以95℃预变性10 min;95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃1 min，β－HCG 33循环和GAPDH 29循环，4℃。③取5 μl PCR液和1 μl 6×DNA上样缓冲液混匀后上样于3%琼脂糖凝胶，另取5 μl 50 bp DNA marker上样，1×TAE电泳缓冲液中180 V电泳20 min，EB染色10 min后凝胶成像系统下观察并保存，以出现144 bp扩增条带为阳性。使用Quantity one V4．62测定条带灰度值，以β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值对β－HCG mRNA进行相对定量分析。④设空白对照、阴性对照和阳性对照，空白对照为不加RNA模板，阴性对照为不加RT酶，阳性对照为清宫术后的葡萄胎组织。每次实验重复3次。

1．5 随访

采用门诊复诊和电话随访相结合的方式。起始事件为诊断妊娠滋养细胞肿瘤，终点事件为肿瘤进展或复发，观察指标为无进展生存期及无疾病生存期。随访截止时间为2014年4月，以月为计算单位。

1．6 统计学分析

应用SPSS 19．0软件进行统计学分析。比较各组β－HCG mRNA表达水平，采用Kruskal－Wallis H检验，两两比较采用秩变换后SNK检验。比较妊娠滋养细胞肿瘤β－HCG mRNA在不同临床参数组的表达情况，采用Fisher确切概率法。显著性水平α=0．05。

2 结果

2．1 总RNA鉴定

OD260 nm/OD280 nm比值为1．7～2．0，1%琼脂糖凝胶电泳EB染色可见18 S和28 S 2条亮带，且28 S条带亮度大约是18 S的2倍(图1)。

2．2 外周血β－HCG mRNA表达情况

10例非妊娠妇女外周血β－HCG mRNA表达均阴性(见图2)。10例正常妊娠妇女外周血中3例肉眼可见β－HCG mRNA扩增条带，条带亮度较阳性对照弱(见图3)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范围为0．01～0．77。15例葡萄胎患者外周血中8例肉眼可见β－HCG mRNA扩增条带，条带亮度不等，较阳性对照弱，(见图4)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范围为0．02～3．56。28例妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中24例肉眼可见β－HCG mRNA扩增条带，条带亮度不等，较阳性对照弱(见图5、6)，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值范围为0．04～4．56。本组中正常妊娠妇女β－HCG mRNA表达水平低于葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤患者(P＜0．05)，但葡萄胎与妊娠滋养细胞肿瘤患者β－HCG mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．3 妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与临床参数的关系

妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与治疗前血B－HCG水平、肺转移及临床分期有关，P＜0．05;而与年龄、前次妊娠、距前次妊娠时间、最大肿瘤大小、预后评分、耐药、化疗疗程及化疗疗效均无关(P＞0．05)。见表1。

表1 妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与临床参数的关系

2．4 妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与预后的关系

28例妊娠滋养细胞肿瘤患者无失访病例，随访时间为6～12个月。28例妊娠滋养细胞肿瘤患者中1例因化疗5个月后出现肺部新病灶判定为肿瘤进展，现仍在化疗中。该病例外周血β－HCG mRNA扩增条带阳性，β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值为4．16，为28例妊娠滋养细胞肿瘤患者中β－HCG mRNA和GAPDH mRNA的灰度比值第二高者(最高者比值为4．56)。28例妊娠滋养细胞肿瘤患者中只观察到1例肿瘤进展事件，无复发事件，截尾值过多，28例妊娠滋养细胞肿瘤患者无进展生存期及无疾病生存期与外周血β－HCG mRNA表达关系无法进行Logrank检验，亦无法采用Cox比例风险回归模型做多因素预后分析。

3 讨论

妊娠滋养细胞肿瘤根据组织学分类包括侵蚀性葡萄胎、妊娠性绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤和上皮样滋养细胞肿瘤。前两者主要由细胞滋养细胞和合体滋养细胞构成，在我国最常见，江西省也属高发地区;后两者主要由中间型滋养细胞构成，较少见。侵蚀性葡萄胎和妊娠性绒毛膜癌在临床表现、诊断和处理原则等方面基本相同，均具有增生活跃、易早期血行转移的特点，2000年国际妇产科联盟(FIGO)妇科肿瘤委员会建议将两者合称为妊娠滋养细胞肿瘤。本研究收集的病例为侵蚀性葡萄胎和妊娠性绒毛膜癌，将两者放在一起讨论，不包括中间型滋养细胞肿瘤。

检测外周血β－HCG mRNA的表达首先需要收集患者新鲜的血液标本，在检测外周血循环肿瘤细胞的相关文献中有些作者采用肝素抗凝［2］，也有些作者采用EDTA抗凝［3］。因有文献提及肝素是一种逆转录的抑制剂，对RNA逆转录成cDNA的过程有较强的抑制作用［4］。本研究采用EDTA抗凝管收集血液标本，并在4 h内处理血液标本。对于所采集的血液标本量各文献报道不一。Cohen等收集了50例转移性结直肠癌患者外周血经免疫磁珠分离技术富集循环肿瘤细胞后，采用流式细胞仪平均每7．5 ml外周血中检测到2个目标细胞［5］。有文献称RT－PCR检测方法可在106～107个正常细胞中检出1个目标细胞，相当于在0．1～1 ml血液中检出1个细胞［6］。本研究在预实验阶段比较了2 ml和4 ml外周血经密度梯度离心后提取总RNA浓度，后者更适合逆转录试剂盒说明书中加1 μg总RNA的要求，因此本研究均采集4 ml外周血用于后续实验。

富集单个核细胞和滋养细胞后最关键的是鉴定滋养细胞，依据合体滋养细胞相对特异性表达β－HCG mRNA，分泌β－HCG蛋白，本研究采用常规RT－PCR方法检测β－HCG mRNA表达以鉴定外周血中的滋养细胞。目前检测外周血循环肿瘤细胞标志物mRNA表达时除常规RT－PCR［2］方法外，还有学者用到巢式RTPCR或实时荧光定量RT－PCR［3］等，后者是目前较热门的鉴定外周血循环肿瘤细胞mRNA表达的方法。但多数文献［3］采用的实时荧光定量RT－PCR仍是相对定量方法，得到目的基因与内参基因的Ct值(循环阈值)后再以2－△△Ct计算样品中目的基因mRNA相对表达量。实时荧光定量RT－PCR相对定量方法更多用于确定不同处理(如细胞干预实验中不同时相)的样本目的基因mRNA的表达差异，适于科研。这种方法用于比较手术前后或不同放化疗时程肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞mRNA表达变化时更佳，但在比较某肿瘤不同患者外周血循环肿瘤细胞mRNA表达情况时采用实时荧光定量RT－PCR绝对定量方法更佳，这需要制备已知目的基因cDNA拷贝数的质粒或化学合成目的基因cDNA，再绘制标准曲线从而计算样本中目的基因mRNA表达量，步骤较为复杂，适于临床应用。吕时铭等［7］将不同细胞浓度的绒癌细胞株(JAR细胞)掺入正常人外周血，经实时荧光定量RT－PCR获得β－HCG mRNA荧光释放曲线并以此为外标准，通过检测妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中β－HCG mRNA荧光释放曲线推算患者外周血中相应肿瘤细胞的量。但由于肿瘤异质性，不同绒癌细胞株、绒癌细胞株与原代绒癌细胞及正常滋养细胞之间β－HCG mRNA表达均存在差异，以单一绒癌细胞株推算妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血滋养细胞数量较为粗略，只能用于估算。鉴于国内外检测妊娠滋养细胞肿瘤外周血循环肿瘤细胞的相关文献较少，且标本量均较少［2，7］，本研究先期采用常规RT－PCR初步检测妊娠滋养细胞肿瘤外周血循环肿瘤细胞β－HCG mRNA表达情况，积累外周血循环肿瘤细胞富集和检测的经验和数据，以便后续采用实时荧光定量RT－PCR绝对定量法检测妊娠滋养细胞肿瘤外周血循环肿瘤细胞β－HCG mRNA表达，深入分析其与妊娠滋养细胞肿瘤早期转移、化疗疗程及疗效、耐药及复发等临床参数的关系，探究其对妊娠滋养细胞肿瘤诊断、治疗和预后的指导意义。

检测非妊娠妇女外周血β－HCG mRNA的表达，可以判断外周血中血细胞成分(主要是单个核细胞)是否表达β－HCG mRNA，以除外其对外周血中滋养细胞表达β－HCG mRNA的影响。本研究收集了10例非妊娠妇女(单纯子宫肌瘤患者)外周血，经外周血密度梯度离心和RT－PCR后均未检测到β－HCG mRNA特异性扩增条带，初步说明外周血中单个核细胞不表达β－HCG mRNA。Hotakainen等［8］曾收集了5例非妊娠妇女和6例男性外周血，其中B细胞、T细胞、粒细胞和单核细胞均表达β－lh mRNA，但均不表达β－HCG mRNA。

妊娠时胎盘绒毛持续浸浴在母血中，绒毛膜上的滋养细胞可通过脱落方式直接进入母血。据此国内外已开展从母血中分离胎儿滋养细胞用于无创性产前诊断的研究。Lim等［9］研究发现胎儿滋养细胞和有核红细胞数量及平均纯化百分比随孕龄增加而下降，孕1～3月母血中胎儿细胞更多，产前诊断宜安排在此期间采血。故本研究选择采集孕2～3月正常妊娠妇女外周血。Taniguchi等［10］在23例正常妊娠妇女(4～32周)中检测到1例孕早期妇女表达α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究收集的10例正常孕早期妇女外周血中3例见β－HCG mRNA特异性扩增条带，但条带亮度较葡萄胎和妊娠滋养细胞肿瘤患者的弱，即正常妊娠妇女外周血β－HCG mRNA表达弱于葡萄胎和妊娠滋养细胞肿瘤患者，可能与葡萄胎和妊娠滋养细胞肿瘤入血的滋养细胞过表达β－HCG mRNA有关，也可能与正常妊娠妇女进入外周血的滋养细胞较葡萄胎和妊娠滋养细胞肿瘤患者少有关。要证实后者需要在滋养细胞鉴定阶段采用保留细胞结构的方法如流式细胞仪检测。

Taniguchi等［10］经外周血密度梯度离心及巢式RT－PCR在7例葡萄胎患者中检测到3例表达α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。本研究在15例葡萄胎患者中检测到8例表达β－HCG mRNA，且表达强于正常妊娠妇女，与妊娠滋养细胞肿瘤患者无明显差异，提示相比正常妊娠妇女，葡萄胎患者入血的滋养细胞过表达β－HCG mRNA或有更多的滋养细胞脱落入血。Taniguchi等［10］在4例绒癌患者外周血中检测到1例表达α－HCG mRNA和β－HCG mRNA。Suzuka等［2］在4例无转移的侵蚀性葡萄胎患者子宫切除术前及术中外周血中均检测到β－HCG mRNA表达，术中β－HCG mRNA表达量最高，术后快速下降，并认为即使无转移外周血也存在滋养细胞播散，手术干预能减少循环妊娠滋养细胞数量。吕时铭等［7］在9例妊娠滋养细胞肿瘤患者治疗前外周血中检测到4例表达β－HCG mRNA，推算肿瘤细胞量为104～107个/10 ml外周血。本研究在28例妊娠滋养细胞肿瘤患者中检测到24例表达β－HCG mRNA，且表达强于正常妊娠妇女，与葡萄胎患者无明显差异，提示相比正常妊娠妇女，妊娠滋养细胞肿瘤患者入血的滋养细胞过表达β－HCG mRNA或有更多的滋养细胞脱落入血。

本研究显示妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA表达与年龄、前次妊娠、距前次妊娠时间、最大肿瘤大小、预后评分、耐药、化疗疗程及化疗疗效无关，与治疗前血β－HCG水平、肺转移及临床分期有关。治疗前血β－HCG＜104mIU/ml组β－HCG mRNA表达阳性率低于治疗前血β－HCG≥104mIU/ml组。Taniguchi等［10］在3例葡萄胎、1例绒癌及1例正常孕早期妇女外周血中检测到的β－HCG mRNA表达量与血清β－HCG成正比。这可能与治疗前血β－HCG高的患者原发灶中肿瘤性滋养细胞负荷高，相应入血的滋养细胞更多有关。无肺转移组β－HCG mRNA表达阳性率低于有肺转移组，同时临床分期Ⅰ/Ⅱ组β－HCG mRNA表达阳性率低于临床分期Ⅲ/Ⅳ组，提示外周血β－HCG mRNA表达与妊娠滋养细胞肿瘤转移有关，可能成为评价妊娠滋养细胞肿瘤早期血行转移的重要指标。本研究随访的28例病例中只有1例进展，无复发病例，目前无法评估外周血β－HCG mRNA与妊娠滋养细胞肿瘤进展及复发的关系。进展的这个病例外周血β－HCG mRNA阳性且相对表达量较高，提示外周血β－HCG mRNA表达可能与肿瘤进展有关，后续可通过增加样本量并延长随访时间来证实。播散在外周血中的肿瘤性滋养细胞可能是妊娠滋养细胞肿瘤复发的重要因素，但由于其复发率相对较低(4%～8%)且复发时间不等(2月～20年)［11］，要评估外周血β－HCG mRNA表达与妊娠滋养细胞肿瘤复发的关系需要多中心研究(增加样本量)并延长随访时间。

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The Relationship between the Expression of β-HCG mRNA in Peripheral Blood and the Hematogenous Metastasis of Gestational Trophoblastic Neoplasia

FAN Sisi，PAN Mei，QIN Haiyan，et al．Nanchang University of Medicine，Nanchang，330006

ObjectiveTo study the expression of β－Human Chorionic Gonadotrophin(β－HCG)in peripheral blood of the patients with gestational trophoblastic tumor，and its relationship with various clinical indicators．MethodsPeripheral blood of 28 cases of gestational trophoblastic tumors，15 cases of hydatidiform moles，10 cases of normal pregnant women and 10 cases of non－pregnant women were collected．Mononuclear cells and trophoblast cells were extracted from the peripheral blood by density gradient centrifugation method，then reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)was used to detect the expression of β－HCG mRNA of the 4 groups．The correlation between the expression of β－hcg mRNA and the clinical indicators of gestational trophoblastic tumor was analyzed．ResultsThe expression of β－HCG mRNA in peripheral blood of 10 cases of non－pregnant women was negative．In 10 cases of normal pregnant women，3 women showed β－HCG mRNA amplified bands．There were 8 cases showed β－HCG mRNA amplified bands in 15 cases of hydatidiform moles．In 28 cases of gestational trophoblastic tumors，β－HCG mRNA amplified bands were seen in 24 patients．The β－HCG mRNA expression of normal pregnancy was lower than that of hydatidiform moles and gestational trophoblastic tumors(P＜0．05)．There were correlation between the expression of β－HCG mRNA and the serumβ－HCG levels before treatment，lung metastasis and clinical stage(P＜0．05)．Only 1 case showed progression among 28 cases during follow－up．No case recurred．ConclusionMononuclear cells in peripheral blood do not express β－HCG mRNA．Trophoblast cells can disseminate into peripheral blood in normal pregnancy，hydatidiform mole and gestational trophoblastic tumor．β－HCG mRNA of trophoblast cell in peripheral blood may be an effective marker in assessing the early hematogenous metastasis of gestational trophoblastic tumor．

Gestational trophoblastic neoplasia;β－Human chorionic gonadotrophin(β－HCG);Density gradient centrifugation;Reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．06．005

R737

:A

:1001－5930(2015)06－0806－06

2015－01－06

2015－04－07)

(编辑:甘艳)

330006南昌大学医学院研究生院(范思斯，郑芳); 330006江西省妇幼保健院(潘玫，秦海燕)

潘玫