胆固醇氧化物分析方法研究进展

方 益， 赵 凯， 周 勇， 赵巧灵*

(1.浙江省海洋水产品质量检验中心，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316000；3.浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316000；4.杭州市质量技术监督检测院，浙江杭州 310000)



胆固醇氧化物分析方法研究进展

方 益1,2,3， 赵 凯4， 周 勇1， 赵巧灵1*

(1.浙江省海洋水产品质量检验中心，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316000；3.浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316000；4.杭州市质量技术监督检测院，浙江杭州 310000)

介绍了胆固醇氧化物种类，综述目前国内外对胆固醇氧化物检测方法：包括油脂提取、胆固醇氧化物纯化、富集，及仪器分析方法对其定性、定量检测。

胆固醇氧化物；胆固醇氧化物检测；色谱分析

胆固醇是有机生物细胞的极为重要的组成部分，广泛分布在所有的生物器官中[1]，但是胆固醇氧化物在光照、加热等环境因素影响时，其内部就会快速发生一系列氧化反应，会造成多种胆固醇氧化产物的产生[2]。胆固醇氧化物可造成生物体内DNA的损坏以及致癌性和致突变性危害[3-4]，胆固醇氧化物在血管内聚集，也会造成血管内膜损伤、神经衰弱和诱发动脉粥样硬化等慢性疾病[5]，对人体的健康有很大的潜在威胁[6]。笔者阐述了形成胆固醇氧化物的各类影响因素，以此为基础，介绍了胆固醇氧化物的提取、富集、净化和色谱分析方法，为分析研究胆固醇氧化物的应用检测提供一定的理论依据。

1 胆固醇氧化物的形成机制

一般未加工过的食品中不含有胆固醇氧化物，但在加工过程中就会产生胆固醇氧化物，当食品在光、热、氧等环境因素影响时，氧化反应就在胆固醇内部快速进行，例如脱氢、脱水等反应，导致多种胆固醇氧化产物的产生(图1)[7]，其自氧化反应的速度由其侧链的长度决定，同时一些自氧化反应需要生物活性酶的参与。胆固醇氧化发生在碳7、碳20和碳25位置上，氧化反应发生时，有一个氢会从第7位的碳上脱去，之后加一个氧形成了差向异构体：3β-羟胆固醇基-5-烯-7α-氢过氧化物和3β-羟胆固醇基-5 -烯-7β-氢过氧化物，其中后者较为稳定[8]。第20位碳和第25位碳的位置上也可能发生脱氢，接着会形成3β-羟胆固醇基过氧化物。在此过程中，此类氢过氧化物结构不稳定，会转变为其他稳定的化合物，包括胆固醇基-5-烯-3β,7α-二醇、胆固醇基-5-烯-7-酮、胆固醇基-5-烯-3β-20α-二醇、胆固醇基-5-烯-3β,25-二醇、5,6α-环氧-5α-胆固醇烷-3β-醇、5,6β-环氧-5β-胆固醇烷-3β-醇、胆固醇烷-3β-醇和胆固醇烷-3β,5α,6β-三醇等[9]。在这些复杂的形态变化中，7-酮胆固醇是一种相当稳定的最终产物。

2 胆固醇氧化物的提取

2.1 脂类物质的提取在食品中，胆固醇氧化物溶解在脂类中，故提取胆固醇氧化物须先提取与之相溶的脂溶性物质，例如酯化游离胆固醇、游离脂肪酸、甘油三酯等，提取的方式有：索氏抽提法、液液萃取法、超声提取法等。在一些研究报道中，使用最频繁的方法是以2种或者3种溶剂以不同的比例来提取，这样可以充分地提取不同脂类物质，同时也可以将其他非脂质物质去除，避免了提取液基质的复杂性。极性和非极性基团同时存在于胆固醇氧化物中，所以使用单一的溶剂提取效果不理想，例如非极性溶剂(正己烷等)和极性溶剂(丙酮、甲醇等)单独使用提取，不适于提取胆固醇氧化物。故需使用不同配比的混合溶剂进行提取，甲醇-氯仿体系[10]经常被用来提取胆固醇氧化物。Hara 等采用正己烷与异丙醇(体积比为3∶2)对胆固醇氧化物提取，能够不使用具有神经性毒性的氯仿，已广泛应用于对胆固醇氧化物提取[11]。也有研究报道了其他方法对胆固醇氧化物进行提取，例如加速溶剂萃取法、超临界萃取法，虽然这些方法的萃取效率和效果都很好，但使用和维护成本较高，故没能广泛应用。在萃取胆固醇氧化物的过程中，要尽量避免体系与氧气的接触，避免胆固醇氧化物再次氧化，用正己烷来溶解提取的油脂，以供下次使用。

2.2 脂类物质的皂化和酯交换胆固醇氧化物在提取物中是痕量级别，所提取脂类物质中含有甘油三酯、酯化游离甾醇、游离脂肪酸等，所以必须对提取的脂类物质进行净化操作，但胆固醇氧化物在净化的过程中会有损失，所以净化方法也是整个胆固醇氧化物检测的关键点。现净化方法主要有以下几种，层析法、酯交换法、皂化法。皂化是碱水解反应，皂化目的是将脂类中甘油三酯和游离脂肪酸变为水溶性盐类物质，能够更加容易除去，在该过程中胆固醇氧化物不受影响。由于油脂具有较为复杂的体系构成，会与其他脂类物质结合，例如游离脂肪酸、苷类物质等，而皂化可解开这些胆固醇氧化物和脂类物质的结合。通过皂化反应，甘油三酯会转化为水溶性盐类，水溶性盐类能够溶于水相中；而胆固醇和胆固醇氧化物等不能被皂化的物质能够溶于有机相中，故可以加入水和有机相(如正己烷等)，从而将胆固醇氧化物与甘油三酯等皂化物分离开来。胆固醇氧化物的组成及稳定性会被皂化过程中皂化温度的高低所影响。过高的皂化温度会增加胆固醇被氧化和胆固醇氧化物被再次氧化的可能性[12]，故目前多采用冷皂化，即在室温或略高于室温下进行皂化。皂化反应多在15 h以上，皂化完毕用有机溶剂(乙醚、石油醚、正己烷等)将未被皂化物萃取出来。

将原有的酯键断裂，形成酸和醇，然后再与其他酸和醇合成新的酯，这一过程称为酯交换反应。甲醇-甲醇钠溶液通常作为酯交换试剂，在酯交换过程中，胆固醇酯中会发生胆固醇与甲醇互换，从而生成脂肪酸甲酯。酯交换过程可以在0.5 h内能完成，具有反应时间短、效率高等优点[13]。Lars Johnsson 等在植物油中加入已知量胆固醇氧化物，通过酯交换、固相萃取小柱洗脱，经仪器分析，分析得到胆固醇氧化物回收率为 95%[14]。

3 胆固醇氧化物的富集

对胆固醇氧化物富集，一般采用SPE柱法进行富集。SPE柱法因效率高、灵敏度高、回收率高，所以越来越受到人们关注。SPE柱法的原理是，根据各种组分与吸附剂之间不同极性进行分离。胆固醇氧化物与其他物质能够使用SPE柱进行分离，通过不同极性溶剂淋洗和洗脱小柱，分离胆固醇氧化物和油脂中其他成分，可达到很好的分离效果。如今SPE柱经过多年的发展，具有了很多类型，如弗罗里硅土小柱、氨基柱、氧化铝柱、硅胶柱等；硅胶柱和氨基柱常被用于胆固醇氧化物的富集，这两款SPE柱都为正相柱。正己烷/乙醚混合溶剂或正己烷单一溶剂并不会将胆固醇氧化物洗脱下[15]。也有研究对比了几款SPE柱对胆固醇氧化物的富集和洗脱效果，如Penazzi等使用ODS柱和硅胶柱洗脱，前者效率最差，后者效率最好[16]。

使用氨基柱富集胆固醇氧化物，使用丙酮洗脱，但洗脱液中会含有一定的杂质，会影响气-质分析，故需要进一步净化[17]。Guardiola 等研究发现，洗脱溶剂会对回收率产生影响，使用正己烷-乙醚混合溶剂洗脱时，回收率最高[18]。Pizzoferrato 等对样品先进行皂化处理，再使用 TLC 法分离不可皂化物，以乙酸∶正己烷∶乙醚=1∶40∶60作为展开剂，分离出胆固醇氧化物[19]。

4 胆固醇氧化物的衍生

胆固醇氧化物具有高沸点、双性基团、化学不稳定性，故气相色谱分析前需进行衍生反应，改变其物理性状，能够有利于气相色谱分析时分离度的改善和检测灵敏度的提高。有研究证明，胆固醇氧化物进行衍生化与非衍生化对比分析中发现，衍生化对色谱分析效果更好[20]。常用衍生试剂有BSTFA (N,O-双三甲基硅烷三氟乙酸胺)[21]；BTZ (N,O-双三甲基硅烷乙酞胺∶三甲基氯硅烷∶N-三甲基硅烷咪哇，3∶2∶3)[22]；吡啶∶三甲基氯硅烷∶六甲基二硅氨烷(9∶3∶1)[23]；Sylon BFT(N,O-双三甲基硅烷三氟乙酞胺：三甲基氯硅烷，99∶1)[24]。吡啶都存在于这些衍生反应中。室温即可满足反应需要，有些研究报道也在80 ℃[25]或120 ℃[26]下进行，反应时间大多数在0.5～1.0 h。

5 胆固醇氧化物的色谱分析

胆固醇氧化物的仪器测定方法有多种，包括气相色谱法[27-28]、高效液相色谱法[29-30]、色-质联用法[31-32]、核磁共振[33]和酶法[34]等。常用的是气相色谱法、高效液相色谱法和色-质联用法。

5.1 气相色谱法气相色谱法经常被用于胆固醇氧化物的检测，使用的色谱柱大多数为非极性、弱极性柱，如：DB-1，DB-5，CP-Si119CB等。一般多以持续升温为主，但也有恒温色谱分析，例如张明霞等采用恒温色谱，几种胆固醇氧化物得到了较好地分离[35]。

5.2 液相色谱法目前，和气相色谱法相比，胆固醇氧化物的检测方面使用液相色谱法还较为少见。液相色谱法在检测胆固醇氧化物方面有几个较为明显的缺点：首先，液相色谱仪所使用的色谱柱的容量和分离效果达不到胆固醇氧化物所需的要求；其次，液相色谱仪的检测器对于胆固醇氧化物的检测就2种，紫外或者荧光检测器，但是大多数的胆固醇氧化物均不能使用荧光或者紫外，因为它们在这些区域内无吸收。当然，使用液相色谱法检测胆固醇氧化物也有其独特的优势，不用担心因为加热等原因而导致胆固醇氧化物的分解，从而影响试验结果。

5.3 色-质联用法气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法统称为色-质联用法，这2种方法可以为胆固醇氧化物的分析测定提供了较为准确、可靠的手段，在平时使用中，以气相色谱-质谱联用法为主。

5.3.1气相色谱-质谱联用法。气相色谱-质谱联用技术在分析检测方面已经有30多年的历史了，在检测研究领域具备了丰富的实践经验。它兼顾了气相色谱和质谱的两者各自的优点，即气相色谱具有较高的分离能力，质谱具有较好的定性定量能力，在目前在世界化学分析领域中属于较好的检测方式之一。

色谱柱通常选用具有低流失的DB-5ms柱，进样口温度与柱箱温度的设置和气相色谱法相近，以氦气作为载气，质谱端采用标准电子轰击离子源(70 eV )，电离温度为200 ℃，离子扫描范围在m/z50～650。表1为几种常见胆固醇氧化物定性定量特征离子峰。

表1 7种胆固醇氧化物的定性定量离子

5.3.2液相色谱-质谱联用法。液相色谱-质谱联用法分析胆固醇氧化物的研究报道较少，其主要原因有2个，其一是设备价格昂贵，普通实验室和研究机构难以承担；其二是液相色谱和质谱之间串联技术的限制。E.Razzazi-Fazeli等用该法对5，6α-epoxyeholesterol、5，6β-epoxyeholesterol、3β-eholestan，5α，6β-triol等7种氧化物使用液质联用仪进行了检测研究[36]，使用乙腈和甲醇作为流动相，色谱柱选择C18柱。

5.4 核磁共振使用核磁共振法在日常检测研究领域较为少见，尤其是在测定胆固醇氧化物方面更加缺少，但是也有学者对此进行了研究，例如A.FONTANN等[33]，他们使用核磁共振技术对鸡蛋粉和小甜饼中的胆固醇氧化物进行了定性和定量研究，因不同的胆固醇氧化物具有完全不同的核磁共振谱的化学位移，然后根据这些化学位移来进行定性定量分析研究。在核磁共振管中加入内标物(苯甲酸甲酯)，使用氘代氯仿溶解胆固醇氧化物。

5.5 酶法从1973年开始，已经有学者使用酶法对胆固醇进行研究，Richmand就用胆固醇氧化酶法对血清中的胆固醇进行定量研究，这种方法已经成为医学临床检测常用方法之一[37]。VeraR等在Richmand的基础上发现胆固醇氧化物在与氧化酶反应后，用特定波长的光束进行测定，其吸光度与胆固醇氧化物浓度在一定范围内呈良好的线性关系[38]，该法对于某些胆固醇氧化物是一种便捷的定量分析法。

6 结论

目前我国对食品中胆固醇氧化物研究较少，并且还未对胆固醇氧化物分析方法建立统一的标准，所以非常有必要建立快速、准确、高效分析食品中胆固醇氧化物的检测方法。

[1] 竺尚武.肉食品中的胆固醇氧化物[J].食品与机械，2004，20(4)：19-21.

[2] OTAEGUI-ARRAZOLA M,MENENDEZ-CARRENO D,ANSORENA I,et al.Oxysterols:A world to explore[J].Food and Chemical Toxicology,2010,48:3289-3303.

[3] ANNE V,GÉRARD L.Cytotoxic effects of oxysterols associated with human diseases:Induction of cell death(apoptosis and/or oncosis),oxidative and inflammatory activities,and phospholipidosis[J].Molecular Aspects of Medicine,2009，30：153-170.

[4] BEATA K,JOAN EL,ROBERT CM,et al.Apoptosis induced by ozone and oxysterols in human alveolar epithelial cells[J].Free Radical Biology &Medicine,2010,48:1513-1524.

[5] JIANLIN Y,XAVIER C,CRAIG M,et al.Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by cholesterol and its oxides in vitro and in vivo[J].Atherosclerosis,2000,148:365-374.

[6] 胡冰，金大勋，范文沟.氧化胆固醇对动脉毒性作用的研究[J].营养学报，1988，10(2)：105-109.

[7] 周建科，陆敏，李敬霞.食品中胆固醇氧化物研究进展[J].河北大学学报，2004，24(5)：550-555.

[8] SMITH L L.Cholesterol Autooxidation[C].New York,USA:Plenum Press,1981:125.

[9] WANG,CHEN H.Kinetic model of eholesterol autoxidation in the Presenee of linoeic acid during heating[J].Shi Pin Ke Xue,1985,25(l):82-93.

[10] JORDI FOLCH,LEES M,SLOANE STANLEY G H.A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissue[J].Journal of Biological Chemistry,1956,226:497-509.

[11] HARA A,RADIN N S.lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent[J].Analytical Biochemistry,1978,90:420-426.

[12] MAERKER G,UNRUH J,CHOLESTEROL OXIDES.1.Isolation and Determination of Some Cholesterol Oxidation Products[J].J Am Oil Chem Soc,1986,63:767-773.

[13] SCHMARR H G,GROSS H B.Analysis of polar cholesterol oxidation products:evaluation of a new method involving transesterification,solid phase extraction,and gas chromatography[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996,44(2):512-517.

[14] JOHNSSON L,DUTTA P C.Determination of phytosterol oxides in some food products by using an optimized transesterification method[J].Food Chemistry,2006,97:606-613.

[15] LAI S M,J L G,ZABIK M E.Evaluation of solid phase extraction and gas chromatography for determination of cholesterol oxidation products in spray-dried whole egg[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43(5):1122-1126.

[16] PENZZI G,CABONI M F,ZUNIN P,et al.Routine high-performance liquid chromatographic determination of free 7-ketocholesterol in some foods by two different analytical methods[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society,1995,72(12):1523-1527.

[17] JOHNSON C B.Isolation of cholesterol oxidation products from animal fat using aminopropyl solid-phase extraction[J].Journal of Chromatography A,1996,736(1):205-210.

[18] GUARDIOLA F,RAFECAS M,BOATELLA J,et al.Comparison of three methods for the determination of oxysterols in spray-dried egg[J].Journal of Chromatography A,1995,705(2):289-304.

[19] PIZZOFERRATO L,NICOLI S,LINTAS C.GC-MS characterization and quantification of sterols and cholesterol oxidation products[J].Chromatographia,1993,35:269-274.

[20] 陈贵凰，杨胜钦，苏正德.市售肌肉及其制品中胆固醇氧化物含量调查[J].食品科学，1993，20(3)：277-290.

[21] LAKE R J,SCHOLES P.Consumption of cholesterol oxides from fast foods fried in beef fat in New Zealand[J].JAOCS,1997,74(9):1069.

[22] PARK P W,GUARDIOLA F,PARK S H,et al Kinetic Evaluation of 3β-Hydroxycholest-5-en-7-one(7-ketocholesterol) Stability During Saponification[J].JQACS,1996,73(5):623-629.

[23] 卢义发，汤政宜.市售蛋制品及头足类产品之胆固醇氧化物含量调查研究[J].食品科学(台湾)，1993，20(2)：168-177.

[24] LI S X,CHERIAN C,AHN D U,et al.Storage,heating,and tocopherols affect T.Hardin,and jeong cholesterol oxide formation in food oils[J].Agric Food Chem,1996,44:3830.

[25] LI S X,CHERIAN G,SIM J S. Cholesterol oxidation in egg yolk powder during storage and heating as affected by dietary oil and tocopherol[J].Journal of Food Science,1996,61(4):721-725.

[26] S MC.GLUSKEY,CONNOLLY J F,DEVERY R,et al.Lipid and cholesterol oxidation in whole milk powder during processing and storage[J].Journal of Food Science,1997,62(2):331-337.

[27] 李楠.水产加工制品中胆固醇氧化物的分布与由来[J].食品与发酵工业，2002，28(6)：27-31.

[28] ANTONIJ ANGULO J,ROMERA JUAN M,RAMIREZ MARIA,et al.Determination of cholesterol oxides in dairy products.effect of storage condition[J].J Agric Food Chem,1997,45:4318-4323.

[29] ZANARDI E,NOVELLI E,GHIRETTI G P,et al.Oxidation stability of lipids and cholesterol in salame Milano,coppa and Parma ham:dietary supplementation with vitamin E and oleic acid[J].Meat Science,2000,55:169-175.

[30] LUF J,HISBERGER W.Oxidation of cholesterol in butter during storage-effects of light and temperature[J].Eur Food Res Technol,2000,211:161-164.

[31] NAM K C,DU M,JO C,et al.Cholesterol oxidation products in irradiated raw meat with different packaging and storage time[J].Meat Science,2001,58:431-435.

[32] BOSELLI EMANUELE,VELAZCO V,CABONI M F,et al.Pressurized liquid extraction of lipids for the determination oxysterols in egg-containing food[J].Journal of Chromatography A,2001,917:239-244.

[33] FONTANA A.1H-NMR Study of Cholesterol autooxidation in egg powder and cookie exposed to adverse storage[J].Journal of Food Science,1993,58(6):1286-1289.

[34] LEBOVICS VERA K,ANTAL MAGDOLNA,GAAL ODON,et al.Enzymatic determination of cholesterol oxides[J].Sci Food Agric,1996,71:22-26.

[35] 张明霞，周建科，梁俊红.胆固醇受热氧化产物研究[J].食品科学，2002，23(5)：99-102.

[36] RAZZAZI-FAZELI E,KLEINEISEN S,LUF W.Determination of cholesterol oxides in proeessed food using high performance liquid chromatography-mass speetrometry with atmospheric pressure chemiealionization[J].Journal of Chromatography A,2000,896:321-334.

[37] RICHMOND W.Preparation and properties of a cholesterol oxidase from Nocardia sp. and its application to the enzymatic assay of total cholesterol in serum[J].Clin Chem,1973,19:1350-1356.

[38] LEBOVICS V K,ANTAL M,GAAL O.Enzymatic determination of cholesterol oxides[J].Sci Food Agric,1996,71:22-26.

Research Progress of Analysis Methods on Cholesterol Oxidation Products

FANG Yi1,2,3, ZHAO Kai4, ZHOU Yong1, ZHAO Qiao-ling1*

(1. Zhejiang Ocean Food Quality Inspection Center, Zhoushan, Zhejiang 316000; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan, Zhejiang 316000; 3. Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhoushan, Zhejiang 316000; 4. Hangzhou Institute of Calibration and Testing for Quality and Technical Supervision, Zhoushan, Zhejiang 316000)

The types of cholesterol oxidation products were introduced, the detection methods of cholesterol oxidation products at home and abroad were reviewed, including the extraction of oil, purification and enrichment of cholesterol oxidation products, the qualitative and quantitative of the method of instrumental analysis.

Cholesterol oxidation products; Detection of cholesterol oxidation products; Chromatographic analysis

浙江省科技计划项目(2013C37077)；质检公益性行业科研专项(201210060)。

方益(1986- )，男，浙江舟山人，助理工程师，硕士，从事色谱分析研究。*通讯作者，工程师，硕士，从事色谱分析研究。

2014-11-28

S 188

A

0517-6611(2015)02-277-03