阿克苏核桃生产园链格孢菌核桃叶枯病的诊断

周玲玲，王晓炜，蒋萍

(新疆农业大学林学与园艺学院 ，乌鲁木齐830052)

阿克苏核桃生产园链格孢菌核桃叶枯病的诊断

周玲玲，王晓炜，蒋萍*

(新疆农业大学林学与园艺学院 ，乌鲁木齐830052)

核桃叶枯病是2010年在和田地区墨玉县托乎拉乡新发现的一种病害，近两年在阿克苏核桃园里也发现了同样症状的病株。从阿克苏核桃主要生产区新和县、温宿县、阿克苏市红旗坡采集典型的核桃叶枯病病样，3个点共切取分离病组织180块，经过培养其中132块病组织上长出同一种真菌——链格孢(Alternariasp.)。用单孢分离法纯化分离物并对其进行致病性测定，结果表明,接种健康核桃叶片后所产生的症状与田间自然发病的症状一致。通过形态学鉴定及分子生物学方法确定病原菌为链格孢菌(Alternariaalternata)。

阿克苏；核桃；链格孢菌；叶枯病；诊断

核桃(JuglansregiaL.)作为新疆的第二大果树，约占全疆林果业总面积的四分之一。到2012年时，种植面积达420万亩，居全国第3位，产量近24万t，主要集中分布在阿克苏地区、喀什地区、和田地区[1]。然而，随着这几年核桃栽植面积的不断扩大，并且大面积集中栽植单一品种，加之近几年受到反常气候的影响以及在核桃产业实际生产中缺乏科学栽培管理经验等多方面因素的影响，病虫害问题表现的日益突出。核桃叶枯病是2010年在和田地区墨玉县托乎拉乡发现的一种新病害，病原菌为链格孢菌(Alternariaalternata)[2]，该病主要为害核桃叶片，造成叶片的变黄焦枯，秋季十月就像火烧一样，严重影响核桃的产量与质量。近几年通过对阿克苏地区核桃主要生产区核桃叶枯病的初步调查，田间发现了与和田地区墨玉县一样的典型病株。本研究采用组织分离法对采自新和县、温宿县、阿克苏市红旗坡的典型核桃叶枯病病样进行病原菌的分离培养，用单孢分离法纯化分离物并对其进行致病性测定，通过形态学鉴定及分子生物学方法确定病原菌,从而明确阿克苏地区核桃叶枯病是否也由同一种病原菌引起。

1 材料与方法

1.1 病样、培养基

采集阿克苏市、温宿县、新和县3个地区典型新鲜病样；PDA培养基、WA培养基、PCA培养基、PSA培养基。

1.2 方法

采用组织分离法分离具有典型症状的新鲜病样，待分离菌物长出后3天，用尖端菌丝挑取法纯化，然后单孢分离进一步纯化直至获得纯培养[3-4]。将菌种接种于PDA培养基上，培养72h进行活化，配成1×106～8/mL孢子悬浮液，进行分离物的致病性测定：设针刺伤和无伤接种2个处理，每个处理重复3次，以无菌水作为对照。接种后，覆盖灭菌湿脱脂棉，套塑料袋保湿48h，于28℃人工气候箱保湿培养。以后每天观察接种部位，并记录接种部位变化，直至5天；对接种后发病的叶片进行病原菌再分离[5]，并对分离物纯化鉴定。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及分离物单孢纯化结果

从阿克苏地区新和县，温宿县，阿克苏市3个地点采集典型核桃叶枯病病样进行病组织分离，共切取了180块组织，经过5d的培养，其中132块组织块上长出同一种真菌——链格孢(Alternariasp.)，如表1所示。分离到的菌物菌落初期为白色后期边缘灰白色，菌落中央颜色变成灰黑色，呈絮状，菌落蔓延生长。在WA平板上进行单孢纯化，纯化结果如图1所示。

表1 阿克苏地区核桃叶枯病病原菌分离结果

注：A、B菌物单孢分离后期；C菌物单孢分离前期

2.2 分离物的致病性测定及再分离结果

用代表分离物接种健康的核桃叶片，7d后有伤接种的开始发病,无伤接种没有发病，15d后刺伤接种的叶片发病率达到100%，无伤接种的发病率为80%。无论是有伤还是无伤接种所产生的症状与田间自然发病的症状一致，而对照组叶片有伤无伤均不发病。对发病的核桃叶片再分离[6]，共切取了120块组织，经过3 d的培养，其中96块组织块上长出同1种真菌——链格孢(Alternariaspp.)，分离率达到80%。

2.3 核桃叶枯病病原菌的鉴定

选取3个具有代表性的菌株WS2-1、AKS2-2、XH2-3进行形态学鉴定。在PSA、PCA上的链格孢菌株的菌落形态无区别，在 PCA 平板上，26 ℃下，12h/12h黑暗与光照下培养5 d，菌落初期为白色，见光后菌落变为暗灰色至暗青褐色，边缘白色，圆形、边缘整齐，菌落背面暗褐色。产孢表型为具短分枝的孢子链；培养基内气生菌丝发达，淡褐色至褐色，有隔，多分枝；分生孢子梗分隔，不分枝，淡褐色至褐色，合轴式延伸，大小(30.5～76.1)μm×(4.3～ 5.7)μm；分生孢子单生或短链生，常产生分枝的链，孢子倒棍棒形、卵形、倒梨形或椭圆形，淡褐色至褐色，表面光滑，具3～8个横隔和1～4个纵、斜隔隔膜，分隔处略缢缩，孢身(11.4～31.7)μm×(4.8～13.1)μm。短喙圆柱形，淡褐色或近无色，(0～14.2)μm×(1.4～5.0)μm。根据病原菌的形态特征与培养特性，初步鉴定为链格孢菌。

注：D分生孢子梗、E分生孢子

图3 病原菌ITS区PCR扩增结果

通过ITS1F-ITS4引物对供试菌株进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得介于500 bp与750 bp之间的清晰条带，经测序得到了长度为560 bp的rDNA ITS序列。将所测序列在 GenBank 数据库中进行同源性比对，发现菌株B1、I-11及b2的序列与链格孢菌株的ITS序列同源性为99%。3个菌株在GenBank注册的序列号分别为KJ004058，KJ004059，KJ004063(如图3所示)。

3 小结与讨论

链格孢菌(A.alternata)是许多植物上的病原菌，也可以腐生在土壤粪便和发霉的植物材料上[7]，寄生性相对较弱。在自然情况下常生于植物的枯死部分(病斑、伤、死部位等)或衰弱的组织上，种子内外，或腐生于多种有机物上或土壤中，在基质表面形成薄厚不同的暗色霉层[8]。

本项目经过实验研究确定新疆阿克苏地区的核桃叶枯病是由链格孢菌(Alternariaalternata)引起。这同2010年在新疆和田墨玉县首次发现的核桃叶枯病的病原菌相同，并且发病症状也相似，发病初期均从核桃叶片的边缘开始逐渐向叶内扩展。初期侵染点周围开始产生褪绿病斑，病斑近圆形，渐渐叶组织坏死变为黑褐色的枯斑，有的有同心轮纹，发病后期叶片变黄枯焦，叶背面或叶正面产生墨绿色霉层，其为病原菌的分生孢子梗和分生孢子。据报道，最早发现的由链格孢菌(A.alternata)引起的核桃叶部病害发生于1998年意大利北部的果园里，它的症状表现为有圆形病斑，并且其坏死斑带黑暗色同心环的组织，病变部位可以蔓延至每片叶片的一半[9]。新疆阿克苏地区发现的链格孢菌核桃叶枯病的症状与此病相似，病原菌种类也相同。

此外链格孢菌不仅能引起核桃的叶部病害，还可引起其它木本植物的叶部发生病害，例如：枸杞叶斑病、阿月浑子褐斑病、苹果斑点落叶病等[10-12]。

[1]新疆维吾尔自治区统计局. 新疆统计年鉴[M]. 北京：中国统计出版社, 2013.

[2]徐阳,刘雪峰,蒋萍,等.和田地区核桃叶斑病病原菌的鉴定[J].西部林业科学,2012,41(3):102-105.

[3]方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社, 1998:24-151.

[4]张天宇. 中国真菌志: 链格孢属[M]. 北京: 科学出版社,2003:1-281.

[5]曲文文,杨克强,刘会香,等.山东省核桃主要病害及其综合防治[J].植物保护,2011.37 (2) :136-140.

[6]于占晶,侯晓杰,崔建州,等.壶瓶枣褐斑病病原菌的鉴定[J].植物病理学报，2010,40(1):7-13.

[7]吴泽民,李宏开,束庆龙.现在林业研究方法[M]. 北京:中国林业出版社,1999：169.

[8]张天宇,中国真菌志16卷 链格孢属[M]. 北京：科学出版社,2003：32-36.

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[10]姜海燕. 枸杞叶枯病病原菌研究[D]. 呼和浩特:内蒙古农业大学, 2003.

[11]杨书宇,孙淑钗,潘桂敏,等.阿月浑子褐斑病病原菌生物学特性研究[J].安徽农业科学，2011,39(19):11472-22473.

[12]张彩霞,陈莹,李壮,等.苹果斑点落叶病致病菌的鉴定及生物学特性研究[J].生物技术, 2011, 21(4): 58-61.

Identification ofAlternariaalternataLeaf Spot ofJuglansregiaL. in Aksu Orchards

Zhou Lingling, Wang Xiaowei,Jiang Ping

(College of Forestry and Horticulture ,Xinjiang Agricultural University ,Urumqi 830052)

The leaf blight ofJuglansregiaL. in hotan region in 2010 on the township of the newly discovered a kind of disease, in recent years in aksuJuglansregiaL. garden also found the same symptoms strain. From xinhe county of aksuJuglansregiaL. main production area, wensu, aksu city collecting typical sample the leaf blight ofJuglansregiaL., taking the separation of three locations in the disease group 180 piece, After training with 132 pieces of disease tissue to grow the same kind of fungus-Alternariaspp. With a single spore isolates separation purification and determination of pathogenic, Results show that after vaccination healthJuglansregiaL. leaf symptoms consistent with the field of natural growth symptoms of the disease. The pathogenic fungus was identified asAlternariaalternateaccording to the morphological identification and molecular biological methods.

Aksu;JuglansregiaL.;Altenariasp.;Leaf spot; Identification

2015-04-07

新疆农业大学大学生创新项目(jqxtp72013168)；新疆维吾尔自治区森林培育重点学科资助

周玲玲(1992-)，女，本科生，E-mail：1577902269@qq.com；*通讯作者：蒋萍，女，副教授，主要从事林果病害的研究，E-mail：xj661105@sina.cn。

S436.64

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.005