青钱柳低聚糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响

刘　姚，傅凌韵，李　楠，王文君

(江西农业大学南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西南昌330045)

青钱柳低聚糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响

刘姚，傅凌韵，李楠，王文君*

(江西农业大学南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西南昌330045)

摘要:探讨青钱柳低聚糖(Cyclocarya paliurus oligosaccharide,CPO)对3T3-L1脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响。采用水提醇的方法得到青钱柳初多糖，经D301-R大孔吸附树脂和DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化，收集CPO作用于3T3-L1前脂肪细胞，并采用Q-PCR测定相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomes proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(CAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα )mRNA表达。结果表明:CPO含有2个组分，其重均分子量分别为3 842 Da和1 481 Da；CPO在低浓度时能促进脂肪细胞的增殖，高浓度时能抑制脂肪细胞的增殖；对脂肪细胞分化的影响较小。CPO可抑制PPARγ和C/EBPα mRNA表达，与对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01)。表明高浓度的CPO抑制脂肪细胞增殖分化水平，其机制可能与抑制PPARγ和C/EBPα mRNA表达有关。

关键词：青钱柳低聚糖；重均分子量；3T3-L1脂肪细胞；PPARγ；C/EBPα

3T3-L1 细胞属小鼠源的成纤维细胞系，是前脂肪细胞，经特殊的诱导分化剂作用后，可以分化为成熟的脂肪细胞，包括在形态学改变、细胞生长、多种脂肪代谢酶的表达，以及脂质积累等方面都能充分展示体内脂肪细胞的特点，是目前国内外进行脂肪细胞功能及糖脂代谢研究中使用最广泛的细胞株之一[1-2]。可脂肪细胞增殖分化失常，导致脂肪组织堆积、脂肪细胞内分泌功能紊乱，继而引起肥胖高脂血症糖尿病和冠心病等与胰岛素抵抗相关的疾病[3]。

青钱柳 [Cyclocarya paliurus (Batal.)Iljinsk] 系胡桃科青钱柳属落叶乔木，又称为青钱李或金钱柳，该属现仅存一种。前期的研究表明，多糖是青钱柳中一类重要的活性物质，具有降血糖、降血脂、增强机体免疫力、抗肿瘤、抑菌、抑制非酶糖基化等活性[4-10]。本研究通过观察CPO对3T3-L1前脂肪细胞增殖及脂肪细胞分化的影响，进一步观察CPO对脂肪细胞分化过程中2个主要基因PPARγ和C/EBPαmRNA的影响，探讨CPO对脂肪代谢的影响机制。

1材料与方法

1.1材料

青钱柳叶子：购于修水县；小鼠3T3-L1前脂肪细胞购于南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2方法

1.2.1青钱柳低聚糖制备称取干燥的青钱柳叶子，按料液比为1∶10加入水，沸水浸提4 h，提取2次，合并2次提取液，减压浓缩，按1∶3加入无水乙醇醇沉，醇沉3次，Sevage法除蛋白(3次)，醇沉，透析，减压浓缩，冷冻干燥，过D301-R大孔吸附树脂进行初步的纯化，透析，冷冻干燥，得青钱柳多糖粉末。取青钱柳多糖粉末用双蒸水配置溶液，3 000 r/min离心10 min，上清液样液过DEAE柱，用质量分数为0.3% NaCl进行梯度洗脱，洗脱速度为0.35 mL/min，收集洗脱液，透析，冷冻干燥，备用。

1.2.2青钱柳低聚糖重均分子量的测定采用的是凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)法和多角度极光散射(Multi-angle Laser Light Scattering，MALLS)法测定高聚物的分子量。流动相为0.01 mol/L NaNO2和质量分数为0.02%叠氮化钠，柱温为35 ℃，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。

1.2.33T3-L1前脂肪细胞的增殖及检测取对数生长期3T3-L1前脂肪细胞，用PBS洗2次，胰酶消化后，用含DMEM完全培养液终止消化，离心去上清，再用DMEM完全培养液调整细胞密度为2×104个/mL。以每孔100 μL体积，将细胞接种于96孔细胞培养板中，于37 ℃ 5%CO2常规培养。待细胞完全贴壁良好后(约12～14 h)吸去培养液，换含样品的DMEM培养液，培养24，48，72 h后[11]，用MTT法进行增殖检测，每空加入新鲜配制的MTT溶液20 μL，置于37℃培养箱中继续孵育4 h，然后吸去孔板中的液体，每空中再加入150 μL DMSO溶剂，轻轻摇晃培养板10 min，使紫色结晶充分溶解，用酶标仪在540 nm波长处测各孔的OD值(药物与诱导液和基本培养液同步跟换，以茶碱[12]作为阳性对照)。

1.2.43T3-L1脂肪细胞的分化及检测取3T3-L1前脂肪细胞以2×104个/mL的密度接种于24孔培养板中，用含有10 %新生牛血清的高糖DMEM培养，待细胞融合2 d后，加含有0.5 mmol/L异丁基-甲基-黄嘌呤、0.25 nmol/L地塞米松、1 μg/mL胰岛素和10%胎牛血清的培养液培养48 h。换含1 μg/mL胰岛素和10%胎牛血清的培养液培养48 h。随后用高糖DMEM基本培养液继续培养。分化第12天进行油红O染色，并测定细胞内甘油三酯的含量(药物与诱导液和基本培养液同步跟换，以茶碱作为阳性对照)。

1.2.5相关基因表达量的检测诱导分化第4天，收集各实验组细胞，利用Trizol 提取各实验组细胞中的总RNA，逆转录合成第一链cDNA，参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov提供的小鼠各基因序列，用Primer Expres3.0软件设计各基因的引物和探针，并由上海生工合成，引物序列和探针序列如下：GAPDH：FP，5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，RF，5′-CCTGCTTCACCACCTT CTTGA-3′，Probe，FAM-TGCCGCCTGGAGAAACCTGC C-TAMRA，登入序列号为NM_008084.2；PPARγ：FP，5′- ATGATGGGAGAAGATAAAATCAAGTTC -3′，RP，5′-GGATG GCCACCT CTTTGCT-3′，PROBE，FAM-AACATATCACCCCCCTGCAGGAGCA- TAMRA，登入序列号，NM_011146.3；C/EBPα：FP，5′- GCGAGCACGAGACGTCTATAGA-3′，RP，5′- GCCA GGAACTCGTCGTTGAA-3′，Probe，FAM-ATCAGCGCCTACATCGACCCGG-TAMRA，登入序列号，NM_007678.3。10 μL PCR扩增体系：cDNA 1 μL，H2O 3.45 μL，MIX 5 μL，FP/RP 0.2 μL，Probe 0.15 μL，ROXⅡ 0.2 μL。PPARγ 退火温度为60 ℃，C/EBPα 退火温度为55 ℃。

1.3数据统计

采用DPS 6.0 统计软件分析实验数据，计量数据以均数±标准差(Means±SD)表示，邓肯式多重比较。以P<0.05为差异有显著性统计学意义。

2结果与分析

图1　青钱柳低聚糖示差色谱图Fig.1　The RI chromatogram of Cyclocarya paliurus oligosaccharide

2.1青钱柳低聚糖重均分子量的测定

经凝胶渗透色谱法和多角度极光散射法后，以洗脱体积(mL)为横坐标，RI (Volts)为纵坐标，CPO的示差色谱图显示出现两个峰，如图1所示，其分析结果见表1。青钱柳低聚糖主要含有两个组分，即青钱柳低聚糖组分 (峰1)和青钱柳多糖组分低聚糖(峰2)，且它们的重均分子量(Mp)分别为3 842 Da和1 481 Da。

表1　青钱柳低聚糖凝胶渗透色谱分析结果

2.2CPO对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

CPO不同质量浓度作用于3T3-L1前脂肪细胞，24、48、72 h几个时间段对3T3-L1前脂肪细胞生长的影响表现为增殖趋势。在低剂量范围内，随着浓度的升高，增殖效果明显，呈现一定的量效关系，实验结果见表2。但高剂量的CPO对3T3-L1脂肪细胞的生长具有一定的抑制作用。与对照组相比，CPO浓度为30 μg/mL 多糖显著促进细胞的增殖，高浓度时均有不同程度的抑制作用。

表2　青钱柳低聚糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖作用量效关系(Means±SD,n=6)

与对照组相比，小写字母表示显著差异(P<0.05)，大写字母表示极显著差异(P<0.01)。

Small or capital letters in the same column means significant,very significant(P<0.05 orP<0.01) when compared with control group.

2.3CPO对3T3-L1脂肪细胞分化的影响

对诱导分化12 d后的脂肪细胞进行油红O染色，拍照，如图 2 所示。前脂肪细胞经诱导之后，由纤维状(图2A)变成圆形，且在倒置显微镜下可清晰地看到脂滴成“指环状”排列在细胞膜内侧(如图中箭头所示)。CPO作用细胞后，细胞裂解液中甘油含量与对照组相比，无统计学上的差异，如图3所示。表明CPO对3T3-L1脂肪细胞分化的影响较小。

A：3T3-L1前体脂肪细胞;B：空白对照组;C：茶碱阳性对照组;D：CPO 15 μg/mL;E：CPO 30 μg/mL;F：CPO 60 μg/mL。A:3T3-L1 preadiposyte;B:blank control;C:theophylline positive control;D:CPO 15 μg/mL;E:CPO 30 μg/mL;F:CPO 60 μg/mL.图2　青钱柳低聚糖对3T3-L1细胞分化后脂肪沉积的影响(油红O染色)(×400)Fig.2　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the fat deposits of differentiated 3T3-L1 adipocytes (Oil Red O staining) (×400)

图3　青钱柳低聚糖对3T3-L1脂肪细胞内甘油三脂的影响(Means±SD,n=6)Fig.3　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the intracellular triglyceride of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

图4　青钱柳低聚糖对3T3-L1脂肪细胞内PPARγmRNA表达的影响(Means±SD,n=6 )Fig.4　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the expession of PPARγ mRNA of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

2.4CPO对3T3-L1脂肪细胞中PPARγ和C/EBPα表达的影响

图5　青钱柳低聚糖对3T3-L1脂肪细胞C/EBPα mRNA表达的影响(Means± SD,n=6 )Fig.5　The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide on the expession of C/EBPα mRNA of 3T3-L1 adipocytes(Means±SD,n=6 )

CPO作用于3T3-L1脂肪细胞后，各实验组细胞中PPARγmRNA的表达量极显著的降低；与阳性对照组相比，青钱柳低聚糖实验组中PPARγmRNA的表达量极显著的降低，如图4所示。细胞中C/EBPαmRNA的表达量极显著的降低，与阳性对照组相比，实验组细胞中C/EBPαmRNA的表达量极显著下降，如图5所示。

3讨论

在高等真核生物中，白色脂肪组织(WAT)是一个重要的能量贮存器官，调控着机体内的能量平衡：当机体内能量过剩时，它就贮存多余的甘油三酯，当机体内能量不足时就动员这些甘油三酯。近年来有研究发现，过多的WAT会提高肥胖率。在工业化国家中，肥胖是一个普遍的健康杀手，与一些病理学疾病密切相关[13-14]，如：非胰岛素依赖型糖尿病、高血压、癌症、胆囊疾病、动脉粥样硬化等。随着人们健康意识的不断增强，迫切需要新的有效的方法来控制肥胖。

前体脂肪细胞在生长滞留期和后期分化过程中会伴随着脂肪细胞基因表达的增加，如：脂肪酸结合蛋白和脂质代谢相关酶类。脂过氧化物体增殖激活化受体家族(PPARs)、CAAT/增强子结合蛋白家族(C/EBPs) 是调控脂肪细胞分化的主要转录因子。这些转录因子的表达与肥胖、高脂血症等疾病的形成和发展密切相关[15]。PPARγ是PPARs家族成员之一，最初被称为调节脂肪特定基因表达和诱导前脂肪细胞分化的转录因子，其最具脂肪组织特异性，在脂肪细胞分化和脂代谢、胰岛素抵抗和糖代谢、炎症反应、酒精肝等中起着重要的作用[16]C/EBP 同源蛋白(C/EBPs)家族有C/EBPα、β、γ等成员，其中C/EBPα在脂肪细胞分化中起着关键性作用，促进PPARα的高表达，保持分化细胞的表型[17]。许多研究表明，C/EBPα与脂肪特异性基因的表达间存在相互作用，如：促进脂肪基因-Glut-4、SCD1、瘦素[18]、422/αP2。

青钱柳多糖是青钱柳的主要有效成分之一，大量研究表明，青钱柳多糖具有降糖降脂的功效。本研究通过对青钱柳多糖进行分离纯化，得到CPO，经GPC和MALLS法分析之后，其重均分子量(Mp)分别为3 842 Da和1 481 Da，表明得到的青钱柳多糖为低聚糖。通过CPO对3T3-L1脂肪细胞进行干预实验，得出CPO在低浓度时能促进脂肪细胞的增殖，高浓度时能抑制脂肪细胞的增殖；细胞裂解液中甘油含量与对照组相比，无统计学上的差异，表明CPO对脂肪细胞分化的影响较小；与对照组比较，CPO可极显著抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表达。实验结果表明，高浓度的CPO抑制脂肪细胞增殖水平，其机制可能与抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表达有关。但体内实验和体外实验的作用还存在一定的差异，因此进一步研究CPO对脂质代谢影响，探讨其在体内实验作用机制及其影响因子具有重要的意义。

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Effect ofCyclocaryapaliurusOligosaccharide on Proliferation and

Differentiation of 3T3-L1 Adipocytes and Related Gene Expression

LIU Yao,FU Lin-yun,LI Nan,WANG Wen-jun*

(Key Lab for Agricultural Product Processing and Quality Control of Nanchang City,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:The effect of Cyclocarya paliurus oligosaccharide (CPO) on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes and the related gene mRNA expression was investigated.CPO was obtained through water solution and alcohol sedimentation,and isolated and purified with D301-R macroporous resins and DEAE cellulose anion exchange resins.The molecular weight was measured with the GPC and MALLS methods.The effect of CPO on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes was studied,and the related expression of PPARγ and C/EBPα mRNA were determined by Q-PCR.The results showed that CPO consisted of two different components and their weight-average molecular weights (Mp) were 3 842 Da and 1 481 Da.CPO promoted the proliferation at the low concentration and restrained it at the high concentration.CPO decreased the expression of PPARγ and C/EBPα with significant differences from the control group(P<0.01).The results suggested

that hith-dosaged CPO restrained the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocytes,which might be related with its inhibiting the expression of PPARγ andC/EBPα.

Key words:Cyclocarya paliurus oligosaccharide；weight-average molecular weight；3T3-L1 adipocyte；PPARγ；C/EBPα

作者简介：刘姚(1988—)，女，硕士生，主要从事分子营养学的研究，E-mail：liuyao20063579@126.com；*通信作者：王文君，教授，博士，主要从事分子营养学的研究，E-mail:wwjun9999@sina.com。

基金项目:国家自然科学基金项目(31160319)、江西省高等学校科技落地计划项目(KJLD13027)、江西省科技厅科技计划项目(2009BGA01900)和江西省教育厅科技计划项目(GJJ13281)

收稿日期：2014-08-19修回日期：2014-10-22

中图分类号：Q254;Q344+.13

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)01-0135-06