siRNA沉默survivin增强hNIS转染的鼻咽癌细胞株对131碘的敏感性

钟 兴， 弓 健， 郭 斌， 徐 浩

（暨南大学附属第一医院1.医学影像中心超声科；2.核医学科，广东广州510632）

siRNA沉默survivin增强hNIS转染的鼻咽癌细胞株对131碘的敏感性

钟 兴1， 弓 健2， 郭 斌2， 徐 浩2

（暨南大学附属第一医院1.医学影像中心超声科；2.核医学科，广东广州510632）

目的：研究Survivin特异性小片段干扰RNA（siRNA）能否增强人钠碘同向转运体（hNIS）转染的鼻咽癌细胞株（CNE-2-hNIS）对131碘的放射敏感性.方法：设计并合成针对survivin基因的特异性siRNA，利用脂质体法转染CNE-2-hNIS细胞，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和Western blot方法检测细胞survivin基因沉默效果.CCK-8、克隆形成实验和AnnexinV FITC／PI双染流式细胞仪检测131碘孵育后对细胞增殖和凋亡的影响.结果：Survivin siRNA转染CNE-2-hNIS细胞72 h后，细胞的survivin基因mRNA和蛋白表达明显降低，Si-survivin组较SiRNA-NC组细胞增殖率降低，131碘孵育后，Si-survivin组较SiRNA-NC组细胞增殖率降低，凋亡率增高，差别有统计学意义（P＜0.05）.结论：Survivin特异性siRNA能显著沉默CNE-2-hNIS细胞的survivin基因的表达，增加CNE-2-hNIS对131碘的放射敏感性.

survivin； RNA干扰； 鼻咽癌； 钠／碘同向转运体； 碘放射性同位素

［Key words］survivin； siRNA； sodium／iodide symporter（NIS）； nasopharyngeal carcinoma； iodine radioisotopes

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中国南方及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，放疗是其首选的治疗方法，但是对于放疗不敏感、放疗后病灶残留或复发，以及发生远处转移的患者，不少学者正积极探索其他有效的治疗手段.钠／碘同向转运体（sodium／iodide symporter，NIS）基因转染非甲状腺源的肿瘤细胞以介导放射性核素治疗肿瘤的研究，为探索内放射治疗肿瘤提供了一个新的研究领域［1-2］.通过前期实验，本项目组已成功建立稳定表达hNIS的鼻咽癌细胞株CNE-2-hNIS，使得原本不能摄碘的鼻咽癌细胞能够摄取放射性核素131碘，经体内、外实验证实131碘能一定程度抑制hNIS转染鼻咽癌细胞增殖，并诱导其凋亡［3-4］，但要达到治疗鼻咽癌的效果，仍需加强131碘对鼻咽癌的治疗作用.研究显示［5］，鼻咽癌组织中survivin基因mRNA和蛋白质有着高表达，并且癌组织中的这种高表达与患者的不良预后密切相关.体外研究结果显示，许多恶性肿瘤细胞中，特别是具有放射抵抗的细胞中可以检测到Survivin的表达上调，Survivin的高表达与肿瘤细胞对放射抗性密切相关［6，7］.为了进一步提高131碘对CNE-2-hNIS细胞的治疗效果，本组利用RNA干扰技术，沉默CNE-2-hNIS细胞株中survivin基因的表达，探讨survivin基因表达抑制后的CNE-2-hNIS细胞能否提高对131碘的敏感性，从而达到增强131碘的治疗效果.

1 材料与方法

1.1 材料

脂质体lipofectamine 2000及胎牛血清购自美国Invitrogen公司，RPMI-1640培养基购自GBICO公司.cDNA反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kits购自Bio-Rad.iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix购自Bio-Rad.辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自Proteintech，ECL试剂盒购自Milipore.蛋白预览marker购自TransGene Biotech.Survivin抗体购自美国CST公司.

1.2 siRNA设计、合成和转染

Survivin siRNA的设计与合成由上海吉玛制药技术有限公司完成.在6孔板中接种处于对数生长期的CNE-2-hNIS（5×105／每孔），待细胞生长至密度达到60%～70%进行转染.转染过程参考lipofectamine 2000转染试剂说明书.转染分2组：转染Survivin siRNA为Si-survivin组（实验组），转染随机对照为SiRNA-NC组（对照组），转染步骤按照说明书进行.转染后72 h进行后续的实验.

1.3 RT-qPCR检测survivin m RNA的表达

Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞弃培养液后PBS冲洗3次，通过Trizol法提取总RNA，用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.设计特异性引物分别扩增survivin和内参Actin（survivin引物序列：上游5′-AGGCTGGCTTCATCCACTGC-3′，下游5′-TGTTCCTCTATGGGGTCGTCA-3′，Actin引物序列：上游5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′）.qPCR反应采用两步法.反应体系：iTaq Universal SYBR Green Supermix 7.5μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，cDNA 1μL，ddH2O 5.9μL.反应条件：95℃2 min，95℃10 s，60℃30 s 39个循坏.溶解曲线程序按照iTaqTNUniversal SYBR®Green Supermix说明书设计.

1.4 Western-blot鉴定Survivin蛋白的表达

Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞弃培养上清液，用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗细胞2次，加入预冷的细胞裂解液（50 mmol／L Tris-HCl，150 mmol／L NaCl，质量分数为0.02%叠氮钠，质量分数为0.1%SDS，质量分数为1%NP-40，质量分数为0.5%去氧胆酸钠，100 mg／L苯甲基磺酰氟（PMSF），1 mg／LA protinin）150μL，用细胞刮将细胞刮下，收集到1.5 mL离心管中，冰浴20 min后，于4℃、12 000×g离心15 min，收集上清液.蛋白样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5 min，每孔上样10μL，质量分数为12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品.分离的蛋白质电转移到PVDF膜上，用封闭液（质量分数为5%脱脂奶粉溶于TBS-T）室温封闭1 h，将膜与用封闭液稀释的Ⅰ抗（小鼠抗人Survivin单克隆抗体1∶400）室温孵育2 h，TBS-T洗膜15 min×3次，将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG第Ⅱ抗体（1∶2 000）室温孵育1 h，TBS-T洗膜15 min×3次，加入ECL试剂显色发光，在暗室中用X-光胶片曝光，显影和定影.

1.5 Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测131碘作用后的细胞增殖活性

Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞常规培养，5 ×105／孔的密度接种于六孔板中，37℃、体积分数为5%CO2条件下过夜培养，弃去旧的培养液，用平衡Hank′s缓冲液（bHBSS）液清洗细胞2遍后，分别加入0、100μCi／mL的131碘的bHBSS，在37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育7 h，吸弃含131碘的bHBSS，并用bHBSS液清洗数遍，胰酶消化，加培养液轻轻吹打成单细胞悬液，细胞计数，然后以5×103个／孔、3×103个／孔、1×103个／孔的密度分别接种于96孔板中（共7块），每孔体积200μL.37℃、体积分数为5%CO2条件下常规培养.分别于培养第1、2、3、4、5、6、7天后，每天取一块96孔板，每孔加入CCK-8 10μL，避免气泡带入孔内干扰读数，37℃继续孵育2 h.用酶标仪在450 nm波长处测定吸收光度，并计算肿瘤细胞增殖率.细胞增殖率＝（实验组吸光度A值一空白组A值）／（对照组A值一空白组A值）×100%.

1.6 细胞克隆形成实验

Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞常规培养，以5×105／孔的密度接种于六孔板中，37℃、体积分数为5%CO2条件下过夜培养，弃去旧的培养液，用bHBSS液清洗细胞2遍后，分别加入0、100μCi／mL131碘的bHBSS，在37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育7 h，吸弃含131碘的bHBSS，并用bHBSS液清洗数遍，胰酶消化，加完全培养基轻轻吹打成单细胞悬液，细胞计数，以200个／孔的密度接种于六孔板中.37℃、体积分数为5%CO2条件常规培养14 d，培养期间要适时更换培养液.培养14 d后，弃旧培养液，PBS小心浸洗2次，加纯甲醇5 mL固定15 min，弃固定液，加适量龙胆紫溶液染色10 min，然后流水缓慢洗去染色液，空气干燥.在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，并计算克隆形成率：克隆形成率＝克隆数／接种细胞数（100%）.

1.7 AnnexinV FITC／PI双染流式细胞仪检测131I作用后细胞凋亡

Si-survivin组和SiRNA-NC组常规培养，以5× 105／孔的密度接种于六孔板中，37℃、体积分数为5%CO2条件下过夜培养，次日，弃去旧的培养液，用bHBSS液清洗细胞2遍后，加入0、100μCi／mL131碘的bHBSS，在37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育7 h，吸弃含131碘的bHBSS，并用bHBSS液清洗数遍，更换完全培养基继续培养，每天观察细胞的变化，于24、48、72 h分别用质量分数为0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶分别消化细胞，用含血清的RPMI1640完全培养液终止消化.将收集细胞约1× 106个／mL，1 000 rpm室温离心5 min，弃去上清.用PBS洗涤细胞2次，室温1 000 rpm离心5 min，弃去上清，重悬于1 mL PBS中.取100μL细胞，约1× 105个细胞，加5μL PI和5μL AnnexinV／FTTC，室温下避光孵育15 min.加400μL孵育缓冲液，1h内进行流式细胞仪检测.在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限（FTTC-／PI-）显示活细胞；右上象限（FITC＋／PI＋）是晚期凋亡细胞；而右下象限（FTTC＋／PI-）为凋亡细胞.

1.9 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件，计量资料实验数据以均数±标准差表示，应用t检验进行两均数间的差异性分析.

2 结果

2.1 Survivin基因表达的鉴定

RT-qPCR结果表明，Si-survivin组的Survivin mRNA表达较SiRNA-NC组降低，两组间差异有统计学意义（P＝0.000 2），见图1.Western blot结果表明，Si-survivin组的Survivin蛋白表达较SiRNA-NC组明显降低，见图2.

图1 RT-qPCR检测Si-survivin组和SiRNA-NC组中Survivin mRNA表达情况Fig.1 Survivin mRNA in Si-survivin group and SiRNA-NC group was detected by RT-qPCR

图2 Western blot检测Si-survivin组和SiRNA-NC组中的Survivin蛋白的表达Fig.2 Expression of Survivin protein in Si-survivin group and SiRNA-NC group was detected by Western blot

2.2 131碘作用后细胞增殖和凋亡的变化

CCK-8检测结果表明，Si-survivin组和SiRNANC组细胞在无131碘的作用时，第3 d Si-survivin组细胞增殖率下降，与SiRNA-NC组比较差别有统计学意义（t＝6.56，P＜0.01）.经过100μCi／mL131碘孵育后，Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞在1～7天增殖率均有一定程度下降，Si-survivin组较SiRNA-NC组细胞增殖率下降更为明显，差别有统计学意义（P＜0.05），见图3.

图3 CCK-8检测0、100μCi／mL131碘作用于SiRNA-NC组和Si-survivin组细胞后在1～7 d细胞增殖率的改变Fig.3 The rate of proliferation of cells in SiRNA-NC group and Si-survivin group detected by CCK-8 after adding 0 and 100μCi／mL131I

体外克隆形成实验试验显示，在无131碘的作用时，Si-survivin组细胞克隆形成率（61.33±4.72）%较SiRNA-NC组（96.14±2.91）%下降，差别有统计学意义（t＝10.87，P＜0.01）.经过100μCi／mL131碘孵育后，两组细胞克隆形成率均有降低，Si-survivin组细胞克隆形成率为（18±2.64）%，较SiRNA-NC组（34.33±3.05）%有明显下降，差别有统计学意义（t＝7.01，P＜0.01），见图4.

图4 SiRNA-NC组和Si-survivin组经0、100μCi／mL131碘作用于后细胞克隆形成率Fig.4 The rate of colon formation of cells in SiRNA-NC group and Si-survivin group after adding 0 and 100μCi／mL131I

图5 AnnexinV FITC／PI双染流式细胞仪检测0、100μCi／mL131碘作用于SiRNA-NC组和Si-survivin组后细胞凋亡情况（A和B为未加131碘作用的SiRNA-NC和Si-survivin组，C和D为加100μCi／mL131碘作用的SiRNA-NC和Si-survivin组）Fig.5 The apoptosis of cells in in SiRNA-NC group and Si-survivin group after adding 0 and 100μCi／mL131Idetected by AnnexinV FITC／PI

AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示，在无131碘的作用时，Si-survivin组和SiRNA-NC组细胞凋亡率差别无统计学意义（t＝1.64，P＞0.05），经过100μCi／mL131碘孵育后，Sisurvivin组和SiRNA-NC组的细胞凋亡率均下降，但Si-survivin组的细胞凋亡率（28.27±4.87）%较SiRNA-NC组（10.54±3.87）%下降更为明显，两者差异有统计学意义（t＝4.93，P＜0.01）.

3 讨论

Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（IAPs）家族中分子量最小但抗凋亡能力最强的成员，主要作用是调控细胞凋亡和细胞分裂.Survivin基因几乎在所有的人类肿瘤细胞中表达，但在正常的末端分化组织中却很少能检测到，因此作为一个肿瘤特异性标记物，其研究逐渐成为肿瘤治疗相关领域的热点.研究［8］表明Survivin能抑制肿瘤细胞凋亡的发生，参与细胞周期的调控，诱导肿瘤血管的生成以及向周围组织浸润，并能增强肿瘤细胞对化疗和放疗的耐受性.Survivin蛋白的高表达与肿瘤细胞对放射抗性密切相关.Rödel等［9］研究显示，运用小干扰RNA降低结直肠癌细胞放射抵抗株SW480和HCT-15中Survivin的表达后，SW480和HCT-15细胞株对放射的敏感性增加，凋亡率增高，该研究的结果亦显示，Survivin的表达水平与直肠癌的患者进行放化疗的预后呈负相关.因此，survivin基因可以作为具有潜在价值的放射性治疗的新靶点，沉默该基因可能影响肿瘤对放射治疗的敏感性.

RNAi是一种通过细胞内导入双链RNA而导致靶基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象.RNAi在细胞内能通过多种途径（如RNA降解、转录抑制、翻译抑制及染色体重组等）引起特异基因的失活.随着对siRNA研究的不断深入，越来越多的研究显示siRNA在基因治疗领域有着潜在优势，与其他几种基因封闭技术相比，siRNA具有更强大、更持久的抑制基因表达的能力，并且具有体积小、序列特异性高和无免疫原性等优点，目前siRNA已经已成为一种新的放、化疗增敏途径［10］.本项目组的研究显示，通过siRNA survivin基因后，CNE-2-hNIS细胞中的survivin的mRNA及蛋白表达明显降低，达到了抑制CNE-2-hNIS细胞中survivin基因表达的效果.

本组前期的实验表明将hNIS转染鼻咽癌细胞株后能引起细胞摄取131碘的增加，能一定程度抑制鼻咽癌细胞的增殖，诱导其凋亡.为了进一步增强131碘对鼻咽癌细胞的杀伤作用，本组将鼻咽癌细胞中的凋亡基因survivin进行抑制，在131碘的作用下，survivin抑制组的鼻咽癌细胞较未抑制组的增殖率及克隆形成率降低，凋亡率明显增高，达到增强131碘对鼻咽癌细胞的治疗作用.

本研究中通过RNA干扰的方法阻断CNE-2-hNIS细胞中Survivin的表达，体外实验结果显示，转染小干扰RNA可以有效阻断Survivin在CNE-2-hNIS细胞中的表达.survivin基因表达下调能够增强CNE-2-hNIS对131碘的敏感性，为鼻咽癌放射性碘的治疗提供了新的思路和方法.

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［责任编辑：陈咏梅］

Survivin special siRNA enhanced radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells transferred human sodium／iodide sym porter gene to131I

ZHONG Xing1， GONG Jian2， GUO Bin2， XU Hao2
（1.Ultrasound Department of Medical Imaging Center；2.Department of Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To explore the effects of siRNA-mediated survivin on the enhancement radiosensitivity of Nasopharyngeal Carcinoma cell transferred Human Sodium／Iodide Symporter Gene（CNE-2-hNIS）to131I.Methods：The survivin siRNA was successfully constructed and was transiently transfected into NPC cell line CNE-2-hNIS by liposome-mediated.The expression of survivin was detected by RT-qPCR and western blot.The proliferation and apoptosis of CNE-2-hNIS after treatment with131I in vitro were detected by CCK-8 cell proliferation，colony formation assay and Annexin V-FITC／PI double-labeled flow cytometry.Results：Significant down-regulation of the survivin protein expression was found after transfection of the survivin-siRNA in CNE-2-hNIS cells.With131I treatment，the rate of proliferation in survivin-siRNA group was gradually lesser，whereas the rate of cell apoptosis was gradually increased than those of SiRNA-NC group.Conclusion：The survivin special siRNA silenced survivin gene of CNE-2-hNIS and enhanced the radiosensitivity of CNE-2-hNIS to131I.

R736.1

A

1000-9965（2015）03-0246-05

10.11778／j.jdxb.2015.03.010

2015-01-13

广东省医学科研基金项目（A2012342）；广东省科技计划基金项目（2011B061200028）

钟 兴（1974-），副主任医师，博士研究生，研究方向：分子影像学Mobile：13725197597；E-mail：tzhxing＠jnu.edu.cn