螺旋藻（Spirulina platensis）生物转化富硒形态对自由基的清除作用

黄 峰， 郭云飞， 陈 昱， 凌钦婕， 黄 峙

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632）

螺旋藻（Spirulina platensis）生物转化富硒形态对自由基的清除作用

黄 峰1，2， 郭云飞2， 陈 昱2， 凌钦婕2， 黄 峙2

（1.佛山科学技术学院医学院，广东佛山528000；2.暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632）

目的：比较研究和评价富硒螺旋藻（SeSP）生物转化产生的主要富硒活性形式在体外清除自由基的活性.方法：利用富硒培养技术制备SeSP，从SeSP中分级提取纯化硒总蛋白（SeSP-TP）、硒藻胆蛋白复合体（SeSPPB）、硒藻蓝蛋白（SeSP-PC）、硒多糖（SeSP-PS）和纳米红硒（Nano-Se）；电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）测定硒含量；超氧阴离子（·O2）和羟基自由基（·OH）化学发光体系检测自由基清除率，Reed-Muench算法计算半数有效浓度（EC50）.结果：SeSP-TP、SeSP-PB和SeSP-PC与不含硒相同形态对自由基的清除作用均显著提高（P＜0.05），对·O2和·OH清除作用的EC50明显降低（P＜0.05），SeSP中SeSP-PB在体外对自由基的清除活性最高，其中SeSP-PC可能起主要作用；SeSP-PS硒的质量分数低，其中硒对自由基清除的增强效应尚不明确；微藻转化的Nano-Se也具有较强的自由基清除活性.结论：SeSP生物转化富硒活性形式对自由基清除的增强效应与活性硒元素的掺入有关，藻体转化生成的富硒蛋白质产生了协同增效作用明显，生物转化纳米硒作为一种新型活性硒形态值得深入研究.

螺旋藻； 硒； 生物转化； 抗氧化剂； 自由基

硒（Se）是人体必需的微量营养元素之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及调节免疫等多方面的生物活性［1］.我国有72%的国土面积属低硒和缺硒区，对广大膳食摄入硒营养不足人群而言，适量补充生物硒源对预防和辅助治疗硒缺乏相关疾病具有重要现实意义.我国在缺硒区通过人群补硒已成功地防治了克山病和大骨节病等地方病［2］.大量研究表明，富硒食品对辅助治疗癌症、心脑血管疾病、关节炎、生殖力减低、糖尿病以及病毒感染等有明显效果［3］.生物体内硒的代谢形态主要为硒代蛋氨酸（Se-Met）和硒代半胱氨酸（Se-Cys），它们均可以掺入到蛋白质分子中.Se-Cys被认为是第21种蛋白质氨基酸，它由双功能终止密码子UGA编码，通过独特的基因转录和翻译调控机制，掺入到数十种硒蛋白中，并构成这一类蛋白质的活性结构域.因此，硒的主要生理功能表现为硒蛋白和硒酶的抗氧化作用［1，3］，其主要作用机制是硒代半胱氨酸构成硒酶／硒蛋白的氧化还原活性中心.

植物来源的有机硒具有低毒和高生物利用度的优点，利用植物富集和转化硒是获取天然含硒抗氧化剂有前景的途径.富硒植物含有丰富的含硒抗氧化活性物质，是具有重要开发价值的硒生物资源.多种富硒植物产品如富硒花椰菜、富硒茶、富硒米及富硒大蒜等已经成功开发利用，其医疗保健作用的主要机制是在体内产生多种不同种类的抗氧化活性分子，包括抗氧化硒酶、硒氨基酸、硒多糖等，清除体内过多自由基［4］.自由基代谢的动态平衡是维系生命健康的基本要素，自由基过多引起生物膜和生物大分子的氧化损伤，这也是肿瘤和神经病变等多种疾病的主要诱因之一.

以前的研究发现，螺旋藻（Spirulina platensis，SP）是微量元素生物富集和转化的适宜载体，螺旋藻在硒质量浓度为4×10-4g·L-1条件下，仍生长良好，可以大量培养转化制备富硒螺旋藻（SeSP）.螺旋藻活性物质主要有藻蓝蛋白、藻多糖等，藻体对硒的生物转化产生硒藻蓝蛋白等含硒活性物质.从SeSP中可提取制备具有抗氧化活性和拮抗肝损伤作用的富硒总蛋白（SeTP）、富硒藻胆体（SePB）、富硒藻蓝蛋白（SePC）、富硒多糖（SePS）［5-8］，此外还利用SeSP生物转化成功制备了纳米元素硒［9-10］，大量实验数据已表明SeSP及其含硒活性成分具有较大的应用开发价值.本实验利用体外抗氧化检测体系对SeSP生物转化的主要硒形态体外抗氧化活性进行比较研究，为开发利用SeSP提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 藻种与培养

钝顶螺旋藻（Spirulina platensis，SP），由暨南大学水生生物研究所提供.采用Zarrouk氏培养基［5］，用5L鼓泡式生物反应器（本实验室自制）培养9 d.培养温度（30±2）℃、pH（9.0±0.5）、光照5 000 lx、光暗周期12／12 h.

1.2 硒的生物转化

采用文献［5］方法培养制备富硒螺旋藻（SeSP）.于培养的第2、4、6 d，在培养液中分3次添加硒，每次加入到培养液中的硒质量浓度为：ρ（Se）＝100 mg·L-1，培养第9 d采收藻细胞.过滤方法采收藻细胞，藻泥经反复冻融和超声处理制备藻细胞裂解液，按文献方法进一步分离提取富硒总蛋白（SeTP）、富硒藻胆体（SePB）、富硒藻蓝蛋白（SePC）［6-7］.过滤后无藻细胞培养残液再经0.45 μm滤膜过滤，4℃离心10 min（6 000×g），收集红硒微粒，红色沉淀经纯水洗涤3次后，悬浮在纯水中或冻干保存备用.富硒多糖（SePS）按文献方法，即藻粉经80℃去离子水热搅拌提取，95%乙醇沉淀去游离蛋白，冻干后为淡黄褐色粉末.

1.3 分析与鉴定

电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）检测硒含量，按文献［11］方法设定参数.样品和标准液用微波消化炉在体积分数10%硝酸中300℃消化3 h，标准曲线质量浓度：1～100 ng／mL，标准液由中国国家标物中心惠赠.蛋白含量用Lowry法［12］、多糖含量用蒽酮法检测［13］.

1.4 自由基检测体系

超氧阴离子自由基化学发光体系采用焦性没食子酸—鲁米诺体系，羟基自由基（·OH）发光体系采用抗坏血酸—Cu2＋—酵母悬液—鲁米诺—H2O2体系［14］.浓度为5 mmol／L的鲁米诺500μL，检测6 s积分发光强度，测试温度为25℃.每1样品浓度设3个平行管，计算平均发光值A，清除率＝（A0-A）／A0，式中A0为未加检测样品时的吸光值.绘制浓度-清除率曲线，实验数据利用Reed and Muench法计算半数有效浓度（EC50），公式如下：EC50＝lg-1［lg D-i（∑P-0.5）］（式中D：最大实验浓度，i为相邻剂量间比例的对数，P为清除率）.

1.6 数据统计分析

2 结果与讨论

2.1 螺旋藻生物转化主要富硒形态及硒质量分数

通过富硒培养生物转化后的SeSP具有产业化和医药应用前景.我们以前的研究证明［15］，SeSP中活性硒形态主要存在于富硒总蛋白、富硒藻胆体、富硒藻蓝蛋白、富硒多糖以及纳米红硒等产品形式中.这些富硒形态中硒的质量分数如表1所示，除富硒多糖中硒质量分数较低（58.5μg·g-1）外，其他藻细胞内存在的富硒活性形态中硒的质量分数较高，介于400～600μg·g-1.按健康成人每天补硒50 μg推算，仅需要100 mg用量，因此适用于医药应用开发和作为功能性营养食品补硒制剂.螺旋藻生物转化产生的纳米红硒中硒的质量分数超过60%，据此推算，成人每天仅需补充约100μg纳米红硒形态（约含硒62μg）即可满足营养要求，适合作为食品添加剂使用.鉴于硒的潜在毒性，对这一新型生物转化活性硒形态的开发应用还有待深入探讨.

表1 SeSP中主要硒形态中硒的质量分数Table 1 Content of Se of different specimen prepared from SeSP

2.2 螺旋藻生物转化含硒蛋白质对自由基的清除作用

从图1A和B可见：1）SP-TP在体外对自由基的清除作用较强，且具有明显的剂量-效应关系；2）反应体系在相同蛋白质量浓度水平下，SeSP-TP对自由基清除作用比SP-TP明显增强；3）反应体系中，蛋白质量浓度为200～800μg·mL-1［推算ρ（Se）为111～445 ng·mL-1］，SeSP-TP对超氧阴离子的清除率可提高30%左右，达显著水平（P＜0.05）.而对于羟基自由基，产生明显清除效应的剂量范围更宽，达到50～1 000μg·mL-1［推算ρ（Se）为28～556 ng·mL-1］.值得注意的是，反应体系中存在过低或过高蛋白质量浓度下，SeSP-TP与SP-TP相比对清除自由基的增强效应均无统计显著意义.从图1C-F可见：含硒藻胆体或含硒藻蓝蛋白对自由基清除效果随反应体系中加入蛋白质量浓度增多而提高，呈现明显的剂量效应关系.在体外反应体系中，当SeSP-PBS蛋白质量浓度大于80μg·mL-1［推算ρ（Se）为37 ng·mL-1］或大于200μg·mL-1［推算ρ（Se）为93 ng·mL-1］时，分别表现出对超氧阴离子和羟自由基清除作用的明显增强效应（P＜0.05）.与SeSP-PBS相似，SeSP-PC在体外对两种自由基的清除作用表现出明显增强效应的质量浓度分别为80μg·mL-1［推算ρ（Se）为37 ng·mL-1］或800μg·mL-1［推算ρ（Se）为367 ng·mL-1］.这些结果表明，螺旋藻生物转化含硒蛋白质中含有低至纳克水平的活性硒元素，即可显著提升其对自由基的清除效率.

A、C、E-对超氧阴离子的清除作用；B、D、F-对羟自由基的清除作用图1 螺旋藻转化含硒蛋白质对自由基的清除作用A、C、E-Scavenging effects on superoxide anions；B、D、F-Scavenging effects on hydroxyl radicalsFig.1 The scavenging effects of protein specimen prepared from SP and SeSP on superoxide anions and hydroxyl radicals

2.3 螺旋藻生物转化含硒多糖对自由基的清除作用

含硒藻多糖体外对自由基清除作用如图2所示.结果表明，在多糖质量浓度为2～128μg·mL-1实验剂量范围内，SP-PS和SeSP-PS对超氧阴离子自由基均呈现浓度依赖性清除效应，但两者之间对该自由基的清除作用没有发现明显差异（图2A）（P＞0.05）.SP-PS和SeSP-PS对羟自由基的清除作用也呈现相似情况，但随反应体系中多糖质量浓度的增加，SeSP-PS在80μg·mL-1，推算ρ（Se）达到4.6μg·mL-1以上时，其对羟自由基的清除率明显高于SP-PS.研究报道大蒜硒多糖、箬竹硒多糖的生物活性明显增强，能有效抑制环境污染物和病毒对细胞的毒害作用，增强红细胞抗氧化损伤的能力.本实验中使用的藻多糖因硒的质量分数较低（58.5μg ·g-1），尚不能确证其中硒的明显增强效应.生物转化硒多糖中的硒主要以形成硒酸酯和硒醇方式存在，由于硒醇极不稳定，接触空气即被氧化，硒酸酯可能是其发挥抗氧化和清除自由基的活性基团，硒酸酯对两种自由基反应性的不同可能是造成SeSPPS只对羟自由基的清除具有增强作用的原因.

A-对超氧阴离子的清除作用；B-对羟自由基的清除作用图2 螺旋藻转化含硒多糖对自由基的清除作用A-Scavenging effects on superoxide anions；B-Scavenging effects on hydroxyl radicalsFig.2 The scavenging effects of polysaccharide from SP and SeSP on superoxide anions and hydroxyl radicals

2.4 螺旋藻生物转化纳米红硒对自由基的清除作用

SeSP转化生成的红硒微粒，经过筛分而得到纳米级的红硒（粒径为10～60 nm）［9-10］，其体外清除自由基作用如图3所示.发现这种红硒微粒对自由基具有较强的清除作用，虽然最大清除率不高，只有25%～30%左右，但比相同剂量的硒代蛋氨酸对自由基清除作用明显增强.需要提出的是，亚硒酸钠在这一剂量范围内不仅未发现对自由基的清除效应，反而会增强自由基产生.我们过去对这种新型硒形态进行了形貌观察和初步活性分析，结果提示在相同剂量时，该纳米硒对超氧自由基的清除作用比硒代蛋氨酸和SeSP中其他含硒活性成分更强［9］.

A-对超氧阴离子的清除作用；B-对羟自由基的清除作用图3 螺旋藻生物转化纳米红硒对自由基的清除作用A-Scavenging effects on superoxide anions；B-Scavenging effects on hydroxyl radicalsFig.3 The scavenging effects of Nano-Se transformed by SeSP on superoxide anions and hydroxyl radicals

2.5 SeSP转化主要硒形态的体外自由基清除活性比较

SeSP提取液基本代表螺旋藻中主要水溶性活性成分，而实验体系是以蛋白质量浓度设定的，考虑到其中主要活性成分的差异，有必要对实验样本进行活性分析和比较.根据上述实验数据，计算实验样品对自由基清除的50%效应的质量浓度（EC50），如表2所示.结果表明，从SeSP分离制备的主要含硒活性形态的EC50均低于未富硒的对应物，藻胆体的EC50最低，表明其对自由基清除作用最强，藻胆体与PC的EC50接近，说明藻胆体清除自由基主要依赖其中的藻蓝蛋白分子.另外，多糖的EC50值较低，说明多糖具有很强的自由基清除活性，SeSPPS与SP-PS对超氧阴离子清除作用的EC50差别不大，可能因为SeSP-PS中硒含量很低，难以表现硒的协同抗氧化作用.但与SP-PS相比，SeSP-PS对羟自由基清除作用的EC50明显降低，则可能与硒在多糖中的活性结构对羟自由基反应性更强所致.同时发现［9-10］，纳米红硒的EC50只相当于Se-Met的50%，元素硒的这一特定形态有必要进行深入研究，以便确定其活性机制.

螺旋藻提取总蛋白中PC约占40%，据此估算当在两种自由基反应体系中加入SeSP-TP达EC50时，其中SeSP-PC的质量浓度分别约为75和130 μg·mL-1.实验数据显示，SeSP-PC清除超氧阴离子的EC50为91.6μg·mL-1，说明SeSP-PC在清除超氧阴离子中扮演主要角色.而SeSP-PC清除羟基自由基的EC50为293.8μg·mL-1，提示除SeSP-PC外，其他含硒活性蛋白质在其中起协同参与对羟自由基的清除.

表2 螺旋藻生物转化富硒形态体外清除超氧离子和羟自由基的EC50比较Table 2 Comparison of EC50 of different specimen prepared from SeSP and SP on scavanging superoxide anions and hydroxyl radicals

3 结论

本研究在对SP活性物质及SeSP含硒组份进行全面分析的基础上［7，15］，分级提取纯化制备了富硒总蛋白、藻胆蛋白复合体、藻蓝蛋白、藻多糖和藻细胞转化纳米红硒等主要富硒形态，对其体外清除超氧阴离子和羟自由基活性进行了初步比较和评价.结果提示，SeSP中富硒蛋白质形态（包括总蛋白、藻胆体、藻蓝蛋白）在体外对自由基清除作用有明显提高，清除超氧阴离子和羟自由基的EC50均明显降低.数据还表明，SeSP中含硒藻胆蛋白复合体在体外清除自由基的活性最高，其主要成分含硒藻蓝蛋白可能发挥关键作用.SeSP与SP相同提取组分相比对自由基的清除作用增强与活性硒元素的掺入有关，以反应体系中加入富硒蛋白质量浓度（EC50）推算其中硒的质量浓度均低于1.0μg·mL-1，相同剂量的无机硒（亚硒酸钠）对超氧阴离子及羟自由基则没有清除作用，有机硒（硒代蛋氨酸）在相同剂量时的清除率水平也只有15%左右.说明在SeSP中，藻体转化生成的富硒蛋白质产生了协同增效作用.本实验中使用的藻多糖因硒的质量分数较低（58.5μg·g-1），尚不能确证其中硒的明显增强效应.另外，微藻转化的纳米红硒也具有较强的自由基清除活性，可能与纳米硒的特定效应有关，这为进一步研究这一新型硒形态有所启示.

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［责任编辑：刘蔚绥］

A comparison study of selenium containing specimen from selenium enriched Spirulina platensis：the scavenging effects on free radicals in vitro

HUANG Feng1，2， GUO Yunfei2， CHEN Yu2， LING Qinjie2， HUANG Zhi2
（1.Medical School，Foshan University，Foshan 528000，China；2.School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To investigate the scavenging effects of selenium（Se）containing specimen from Se enriched Spirulina platensis（SeSP）on free radicals in vitro.Methods：SeSP was cultivated and prepared by the optimized procedure with Se-enriched medium.Specimen of Se containing total protein（SeSP-TP），phycobiliprotein complexes（SeSP-PB），phycocyanin（SeSP-PC），polysaccharides（SeSPPS）and nano red elemental Se（Nano-Se）were isolated and purified from SeSP.Se contents were measured by the inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）instrument after microwave diges-tion.The scavenging activity of different Se containing specimen on superoxide anions（·O2）and hydroxyl radicals（·OH）were monitored by chemiluminescence method in vitro，and the median effect concentration（EC50）was calculated by Reed-Muench algorithm.Results：The scavenging activities of SeSP-TP，SeSP-PB，and SeSP-PC on·O2and·OH were all elevated significantly（P＜0.05），which was clearly in consistent with the decreased EC50s to·O2and·OH scavenging in comparison with those of specimen from SP.Among the Se containing specimen in SeSP，SeSP-PB was confirmed to be the strongest scavenger and SeSP-PC served as a dominant player in scavenging radicals.As a novel active elemental Se species，Nano-Se bio-transformed from SeSP was detected high potent to radicals removing.While，the SeSP-PS was found no obviously enhancement on the radicals scavenging activity due to the low Se content binding to PS molecular.Conclusion：Se inserting into the specimen，especially the proteins by bio-transformation，result in a synergistic effect of the antioxidants to clean out radicals.In prospective，activities and medical values of the novel bio-transformed Nano-Se should be explored in further.

Spirulina platensis； selenium； bio-transformation； antioxidants； free radicals

Q949.221.05

A

1000-9965（2015）03-0202-06

10.11778／j.jdxb.2015.03.002

2015-02-02

国家自然科学基金项目（20975045）；广东省科技计划项目（2012B031800437；2013B010404029）；广东省基金重点项目（2014A030311026）

黄 峰（1963-），副教授，男，研究方向：肝损伤、再生与修复，E-mail：hffoshan＠126.com

黄 峙（1968-），男，教授，博士生导师.研究方向：硒蛋白家族、钙蛋白酶系统、细胞应激信号转导.Tel：020-85220219，E-mail：thsh＠jnu.edu.cn