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大孔吸附树脂AB- 8分离肉桂原花青素的研究

2015-02-24张加研雷福厚刘祖广

生物质化学工程 2015年1期
关键词:聚合度抗氧化性肉桂

姜 倩,张加研,雷福厚,刘祖广

·研究报告——生物质活性成分·

大孔吸附树脂AB- 8分离肉桂原花青素的研究

姜 倩1,张加研,雷福厚2,刘祖广2

(1.西南林业大学 材料工程学院,云南 昆明 650224;2.广西民族大学 广西林产化学与工程重点实验室,广西 南宁 530006)

采用AB- 8大孔吸附树脂分离肉桂原花青素, 将1 000 mg肉桂原花青素初提物溶解在少量60%乙醇中,制得的浓溶液匀速加入吸附柱中,分别用10%、50%、70%、100%体积分数的乙醇对吸附在树脂上的原花青素进行梯度洗脱。从10%乙醇的洗脱液中可以得到F10290 mg,从50%乙醇的洗脱液中可以得到F50150 mg,从70%乙醇的洗脱液中可以得到F70410 mg,从100%乙醇的洗脱液中可以得到F10080 mg。4部分中,纯度最高的为F10,为90.03%,纯度最低的为F100,为42.11%。洗脱过程中原花青素回收率达到93%。分析不同体积分数的乙醇洗脱液中原花青素平均聚合度和抗氧化性,结果显示10%~50%乙醇洗脱液中主要为低聚体,而70%~100%乙醇洗脱液中主要为高聚体,10%乙醇洗脱液中原花青素的抗氧化性最高,对DPPH ·清除的IC50为0.91 g/L。

原花青素;分级处理;抗氧化性

通常所称的肉桂为樟科乔木植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干皮和粗枝皮[1],肉桂树的嫩叶(桂枝)、幼嫩果实(桂丁)、叶都可以入药[2]。在我国肉桂主要分布于广西、广东,其次是海南、云南、福建,而四川、江西、贵州、湖南、浙江、台湾南部也有少量的栽培,到2000年为止,全国肉桂产量占世界的38.1%[3],而广西、广东两省肉桂产量占我国肉桂产量的95%以上[4]。广西作为我国最大的肉桂产区,主要分布于防城与西江流域[5]。原花青素属黄酮类物质,以儿茶素、表儿茶素及其取代物作为结构单元,具有多种生物活性,在食品、保健品、化妆品等领域具有广泛的应用前景[6],1995年被美国公众评为最受欢迎的10种植物药之一[7]。按照原花青素聚合度的大小,通常将二~四聚体称为低聚原花青素(OPC),五聚体以上的称为多聚原花青素(PPC),OPC与PPC相比,OPC在抗氧化、酶抑制、预防心血管疾病、抗癌、抗炎止痛、止血、增进免疫调节,促进心脏缺血后复苏,防止动脉硬化,减少对皮肤的刺激和抗糖尿病等方面有显著的生物活性[8],其在体内的抗氧化能力是VE的50倍、Vc的20倍[9]。Gu等[10]对41种食品中原花青素的含量进行评价,发现肉桂中原花青素含量最高,然而其中高聚原花青素占49.3%,高聚原花青素由于受到空间位阻的影响,生物活性降低。因此为了有效发挥原花青素的抗氧化性,需对原花青素进行分级处理,富集原花青素低聚体成分,提高原花青素生物功效。本实验采用资源丰富的广西肉桂为原材料,提取的原花青素以及用AB- 8大孔吸附树脂对肉桂原花青素按聚合度进行分离,以期为肉桂原花青素的工业化生产及应用提供参考。

1 实 验

1.1 材料与仪器

无水乙醇、甲醇、丙酮、香草醛、盐酸(分析纯,上海国药集团有限公司);(+)-儿茶素标准品、(- )-表儿茶素标准品、原花青素标准品(国家标准物质检定所), 1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH ·),AB- 8大孔吸附树脂。TU-1810DASPC型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),Agilent 1200series 高效液相色谱仪。

1.2 肉桂原花青素的提取

1.2.1 原花青素的提取 分别称取5 000.0 mg 肉桂粉末(0.078~0.178 mm)于500 mL三口烧瓶中,分别量取蒸馏水、无水乙醇、 60%乙醇、无水丙酮各150 mL,置于预热的50 ℃恒温水浴锅中,安装好冷凝管、磁力搅拌器搅拌,启动搅拌装置提取1.5 h,随后取出烧瓶并冷却至室温,过滤后,滤液利用石油醚萃取,萃取液用旋转蒸发器于45±5 ℃减压干燥,得到干燥肉桂原花青素初提物,称质量,利用公式(1)计算出初提物提取率。

(1)

式中:y—初提物提取率,%;m—肉桂粉末质量,mg;m1—初提物质量,mg。

1.2.2 初提物中原花青素含量以及原花青素提取率测定 在实验室现有条件下用香草醛-盐酸法测定原花青素的含量[11],称取2 mg初提物,置于10 mL比色管中,用甲醇定容,将其配制成0.2 g/L的初提物甲醇溶液,取0.5 mL初提物甲醇溶液加入10 mL比色管中后,依次加入3 mL 40 g/L的香草醛-甲醇溶液,1.5 mL浓盐酸,加塞摇匀,在20±1 ℃避光条件下反应15 min后,于500 nm处测其吸光度,利用(+)-儿茶素标准品建立标准曲线,称取10 mg(+)-儿茶素标准品,甲醇溶解定容至25 mL,质量浓度为0.4 g/L,混匀(避光保存)。分别取0、 2、 4、 6、 8、 10 mL至10 mL比色管中,甲醇定容至 10 mL(质量浓度分别为:0、 0.08、 0.16、 0.24、 0.32、 0.4 g/L)。在上述条件下反应并测定吸光度,以此绘制(+)-儿茶素标准曲线。利用标准曲线计算得到溶液中原花青素浓度,并利用公式(2)计算初提物中原花青素质量分数。

(2)

式中:y1—初提物中原花青素质量分数,%;ci—初提物甲醇溶液中原花青素质量浓度,g/L;Vi—初提物甲醇溶液体积,mL;mi—初提物质量,mg。

利用公式(3)计算出原花青素提取率。

(3)

式中:y2—原花青素提取率,%;y1—初提物原花青素质量分数,%;m—肉桂皮粉末质量,mg;m1—初提物质量,mg。

1.3 AB- 8大孔吸附树脂对原花青素分级处理

1.3.1 原料的制备 选择原花青素提取率最高的提取条件进行提取,提取后溶液用石油醚萃取,萃取后溶液用旋转蒸发器于45±5 ℃温度下蒸馏除去乙醇、水,既得所需原料样品。

1.3.2 原花青素的分级 将1 000 mg肉桂原花青素初提物作为样品溶解在少量60%乙醇中,制得的浓溶液匀速加入吸附柱中,依次用10%、 50%、 70%、 100%体积分数的乙醇溶液进行梯度洗脱,分批收集不同体积分数乙醇的洗脱液。

1.3.3 样品原花青素含量及回收率测定 对各部分洗脱液于45±5 ℃温度下旋转蒸发回收溶剂,所得样品分别标记为F10、F50、F70、F100,称质量并利用公式(4)计算回收率。

(4)

式中:R—样品回收率,%;mi—各部分洗脱液所得样品质量,mg;m样—上柱样品质量,mg。

按照1.2.2节所述香草醛-盐酸法测定样品中原花青素含量。

1.4 平均聚合度的测定

1.4.1 测定原理 本试验采用HPLC法测定聚合度,然而HPLC法不能直接测定原花青素(PC)的平均聚合度,测定之前先采用硫解法预处理,PC可在亲核试剂存在的酸性条件下降解,末端的黄烷3-醇结构单元(儿茶素或表儿茶素)被释放出来的同时,另一结构片段(延伸单元)中C环4位所形成的碳正离子易被适当的亲核试剂捕捉,从而形成亲核试剂附加产物。这两个片段可直接由HPLC得到对应的峰面积,利用建立的(+)-儿茶素、 (- )-表儿茶素、硫解目标产物的峰面积标准曲线,计算得到对应的物质的量。然后利用公式计算聚合度。

1.4.2 色谱分析条件 色谱柱:Agilent Analytical Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,0.5 μm);流动相A:水(含TFA 0.1%),B:乙腈体系(含TFA 0.1%);梯度洗脱0~40 min (4%~25% B),40~45 min (25%~30% B),45~55 min(30%~95% B),55~65 min(95%~4% B);柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;进样量0.01 mL;检测波长280 nm。

1.4.3 标准曲线的建立

1.4.3.1 (+)-儿茶素标准曲线的建立 分别称取(+)-儿茶素标准品0.000 1、 0.000 2、 0.000 6、 0.001 2、 0.001 8和0.002 8 mg,置于10 mL容量瓶,用甲醇定容,不同浓度的(+)-儿茶素甲醇溶液,过滤后进行高效液相色谱分析,以(+)-儿茶素质量为横坐标,以峰面积为纵坐标建立标准曲线并拟合回归方程。

1.4.3.2 (- )-表儿茶素标准曲线的建立 分别称取(- )-表儿茶素标准品0.000 1、 0.000 2、 0.000 6、 0.000 8、 0.001 2和0.001 8 mg,置于10 mL容量瓶,用甲醇定容,不同浓度的(- )-表儿茶素甲醇溶液,过滤后进行高效液相色谱分析,以(- )-表儿茶素质量为横坐标,以峰面积为纵坐标建立标准曲线并拟合回归方程。

1.4.3.3 硫解目标产物标准曲线的建立

A)硫解反应:样品溶液配制:精确称取提取获得的肉桂原花青素样品10 mg置于10 mL容量瓶,用 60%乙醇定容,得到质量浓度为1 g/L的溶液。2-巯基乙醇反应液的配置:分别精确量取2.5 mL 2-巯基乙醇、 27.5 mL乙醇、 16 mL蒸馏水、 4 mL 4%盐酸水溶液,充分混匀。硫解反应:分别取0.1 mL样品溶液、 0.4 mL 2-巯基乙醇反应液于试管内,充分混匀,以0.1 mL 60%乙醇、 0.4 mL 2-巯基乙醇反应液为对照。于70 ℃恒温水浴条件下反应4 h,放置室温冷却。

B)硫解目标产物的HPLC分析及制备:利用硫解反应液,2-巯基乙醇标准品溶液、(+)-儿茶素、(- )-表儿茶素标准品进行HPLC分析,得到反应产生的硫解目标产物的波峰。将硫解反应扩大,反应后溶液经大孔树脂HP-20吸附,用蒸馏水洗脱,除去剩余的2-巯基乙醇、盐酸等,用甲醇洗脱后溶液用旋转蒸发蒸干后既得到硫解目标产物。将样品用少量蒸馏水溶解,上Sephadax柱,依次用400 mL 20%、 40%、 60%、 80%甲醇洗脱,以薄层层析为指导合并洗脱液,再以HPLC分析为指导,找到硫解目标产物,将硫解目标产物干燥。然后将硫解目标产物用少量蒸馏水溶解上CG161M柱进行纯化,依次用200 mL 10%、 30%、 50%、 70%、 80%甲醇洗脱,以薄层层析为指导合并洗脱液,再以高效液相色谱分析为指导,找到硫解目标产物,将硫解目标产物命名为2-ME-ec[12]。

C)建立标准曲线:以制备的硫解目标产物为标准品,分别称取硫解目标产物0.000 5、 0.001、 0.002、 0.004、 0.006和0.008 mg,置于10 mL容量瓶,用甲醇定容,不同浓度的硫解目标产物溶液,过滤后进行高效液相色谱分析,以硫解目标产物质量为横坐标,以峰面积为纵坐标建立标准曲线并拟合回归方程。

1.4.3.4 平均聚合度的计算 待测样品按照1.4.3.3节硫解反应的方法处理以后,经HPLC分析检测得到其相对应的(+)-儿茶素、(- )-表儿茶素、硫解目标产物的峰面积,再根据相对应的标准曲线计算得到相对应的物质的量,由公式(6)计算出其平均聚合度。

(5)

1.5 抗氧化性的测定

本实验采用测定DPPH ·自由基清除率来评价样品抗氧化性,DPPH ·自由基清除率越高则说明该样品抗氧化性越强。将F10、 F50、 F70、 F100以及Vc(Vc作为对照品)用60%乙醇配制成不同浓度的溶液,浓度分别为0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5 和4.0 g/L,用60%乙醇配制100 mL 0.000 2 mol/L 的DPPH·自由基溶液,向2 mL DPPH ·自由基溶液中加入2 mL样品溶液,使总体积为4 mL,摇匀,避光,于40 ℃水浴中放置30 min后,测定其在517 nm处的吸光值(A样品);向2 mL 60%乙醇中加2 mL样品,记录吸光值(A对照),向2 mL 60%乙醇中加2 mL DPPH ·自由基溶液,记录吸光值(A空白),即空白对照。

η=1-(A样品-A对照)/A空白×100%

(6)

式中:η—DPPH ·自由基清除率,%;A样品—DPPH ·自由基溶液与样品溶液反应后吸光光度值;A对照—60%乙醇中加入样品后吸光光度值;A空白—DPPH ·自由基溶液中加入60%乙醇后吸光光度值。

1.6 红外光谱试

分级后的样品采用溴化钾压片法(溴化钾与样品质量比100 ∶1)进行红外光谱测定,与原花青素标准品的红外光谱进行对照。

2 结果与讨论

2.1 原花青素提取试验结果

2.1.1 初提物原花青素含量

2.1.1.1 标准曲线的建立 以(+)-儿茶素标准品所作标准曲线,拟合回归线性方程:y= 353.516 2x-14.230 8,相关系数R2= 0.999 6,式中:x为(+)-儿茶素质量浓度,g/L;y为吸光度。

2.1.1.2 初提物原花青素含量 无水乙醇、60%乙醇、无水丙酮、蒸馏水4种溶剂对肉桂原花青素进行提取,但是由于用蒸馏水提取原花青素,提取液很难在旋转蒸发器下浓缩干燥,因此无法完成后续测定。从表1中可以得到利用无水乙醇、60%乙醇、无水丙酮3种溶剂提取肉桂原花青素,初提物提取率分别为11.39%、 12.72%、 11.95%,初提物中原花青素质量分数为75.38%、 85.25%、 71.32%,原花青素提取率分别8.58%、 10.84%、 8.52%。因此从提取物原花青素的含量来看,可以确定肉桂原花青素的提取溶剂为60%乙醇。

2.1.2 初提物提取率以及原花青素提取率 表1为初提物提取率、原花青素含量以及原花青素提取率,从表1可以看出,利用无水乙醇、60%乙醇、无水丙酮3种溶剂提取肉桂原花青素,利用公式(1)计算初提物提取率分别为11.39%、 12.72%、 11.95%,利用公式(3)计算原花青素提取率分别为8.58%、 10.84%、 8.52%,3种溶剂提取效果的明显不同,是由于无水乙醇以及丙酮的极性与60%乙醇相比较小,与肉桂原花青素的极性相比存在较大差异,而60%乙醇与肉桂原花青素的极性差异较小,根据相似相溶原理,60%乙醇对肉桂原花青素的提取率最高,因此可以确定肉桂原花青素的提取溶剂为60%乙醇。

表1 肉桂原花青素初提试验结果

表2分级处理试验结果

2.2 分级处理试验结果

表2为分级处理实验结果,大孔吸附树脂AB- 8 吸附肉桂原花青素,经10%、 50%、 70%、 100%乙醇梯度洗脱后得到4部分样品,样品分别标记为:F10、F50、F70、F100,4部分中质量最大的是F70为410 mg、纯度为87.21%;样品纯度最高的是F10为90.03%;F100纯度较低为42%,整个过程的回收率为93%。AB- 8大孔吸附树脂为弱极性树脂,在吸附过程中树脂与极性较小部分作用力较强,而对于解吸过程中,不断增加乙醇浓度,洗脱液极性逐渐减小,依据相似相溶原理极性较大的部分被最先洗脱下来,极性较小的部分被最后被洗脱下来,因此F10部分极性大于其他3个部分,F100部分的极性最小。

2.3 平均聚合度测定

2.3.1 标准曲线的建立

2.3.1.1 (+)-儿茶素标准曲线的建立 按1.4.3.1节配制不同浓度的(+)-儿茶素标准品甲醇溶液,过滤后进行HPLC分析。所得标准曲线经拟合回归后得到线性方程:y=513.2x+11.462,R2=0.999 2,式中:x为(+)-儿茶素质量,mg;y为吸收峰面积。

2.3.1.2 (- )-表儿茶素标准曲线的建立 按1.4.3.2节配制不同浓度的(- )-表儿茶素标准品甲醇溶液,过滤后进行HPLC分析。所得标准曲线经拟合回归后得到线性方程:y=618.43x+6.791 3,R2= 0.999 9,式中:x为(- )-表儿茶素质量,mg;y为吸收峰面积。

2.3.1.3 硫解目标产物标准曲线的建立 按1.4.3.3节制备的硫解目标产物2-ME-ec为标准品,配制不同浓度的硫解目标产物溶液,过滤后进行HPLC分析。所得标准曲线经拟合回归后得到线性方程:y=309.76x-15.298,R2= 0.999 9,式中:x为2-ME-ec质量,mg;y为吸收峰面积。

2.3.2 平均聚合度计算 样品与巯基乙醇反应产物经HPLC分析,得到相对应的(+)-儿茶素、(- )-表儿茶素、2-ME-ec的峰面积,由公式(6)计算出其平均聚合度,各部分物质的量及聚合度结果如表3所示,利用60%乙醇提取肉桂原花青素得到原料聚合度为6.2,对吸附在大孔吸附树脂上的原料进行洗脱,10%乙醇溶液洗脱下来的部分聚合度为2.7,50%乙醇溶液洗脱下来的部分聚合度为4.5,70%乙醇溶液洗脱下来的部分聚合度为7.1,100%乙醇溶液洗脱下来的部分聚合度为6.9。因此当乙醇在10%~50%时洗脱下来的原花青素平均聚合度为2~5,可以认为主要为低聚体;当乙醇在70%~100%时洗脱下来的原花青素平均聚合度大于5,可以认为主要为高聚体。

表3 AB- 8大孔吸附树脂分离原花青素结果

2.4 抗氧化试验结果

表4 不同组分及聚合度对DPPH ·自由基清除的IC50值

抗氧化性与聚合度的关系如表4所示,可以得出聚合度越低抗氧化性越高,原花青素的抗氧化性取决于其分子结构及分子中大量酚羟基的存在[13],随着聚合度的增加,分子中越来越多的酚羟基形成了分子内氢键,使其自由基清除能力呈下降趋势[14]。图1为分级处理后每部分样品浓度与抗氧化性之间的关系,通过拟合方程,F10、 F50、 F70、 F100样品及Vc 的IC50值分别为0.91、 1.28、 1.37、 1.71和3.21 g/L,在同一浓度时,F10部分的自由基清除率都明显高于其他4个部分,当质量浓度为4 g/L时F10、 F50、 F70、 F1004部分以及Vc清除率分别为:93.54%、 81.34%、 79.83%、 77.54%、 52.33%,说明F10的抗氧化性大于其他4个部分,同时可以得到Vc的IC50值是肉桂原花青素低聚体IC50的3.5倍,也就是肉桂原花青素低聚体的抗氧化性是Vc的3.5倍。

图1 不同组分对DPPH ·自由基的清除率 图2 红外光谱图

Fig.1 The scavenging rate curves of different

Fig.2 IR spectrafractions for DPPH·

2.5 分级产物的红外光谱分析

比较原料、F10、F50、F70以及F1005个红外光谱图,特征碳骨架振动产生特征峰的波形、频率和强度相近,同时与标准品原花青素的光谱特征极为相似,如图2中可以看到肉桂原花青素的特征骨架振动主要集中在3600~3000、1700~1000和850~650 cm-1区域。其中3450.60 cm-1峰为原花青素分子中羟基的伸缩振动;1624.05、 1533.40和1460.11 cm-1是苯环的骨架振动特征吸收峰;1 265.30、1 055.06 cm-1吸收峰为C环中的C—O—C伸缩振动;1112.94 cm-1吸收峰为C环中的C—H伸缩振动;当苯环上有3个相邻的H存在时,指纹区域850~750 cm-1出现较强的吸收峰,在图中807.61、 787 cm-1的吸收峰,可能是原花青素C2、 C3、 C4结构中3个相邻H产生的。

3 结 论

3.1 采用无水乙醇、60%乙醇、无水丙酮3种溶剂对肉桂原花青素进行提取,初提物提取率分别为11.39%、 12.72%、 11.95%,初提物中原花青素为75.38%、 85.25%、 71.32%,原花青素提取率分别8.58%、 10.84%、 8.52%,确定肉桂原花青素的提取溶剂为60%乙醇。

3.2 大孔吸附树脂AB- 8吸附肉桂原花青素初提物,经10%、 50%、 70%、 100%乙醇梯度洗脱后得到4部分样品,样品分别标记为:F10、F50、F70、F100,4部分中质量最大的是F70为410 mg、纯度为87.21%;样品纯度最高的是F10为90.03%;F100纯度较低为42%,整个过程的回收率为93%。

3.3 洗脱液中原花青素的平均聚合度随乙醇浓度的提高而升高,当乙醇在10%~50%时洗脱液中原花青素的平均聚合度为2~5,可以认为主要为低聚体。当乙醇在70%~100%时洗脱液中原花青素的平均聚合度为大于5,可以认为主要为原花青素高聚体。

3.4 原花青素抗氧化活性受聚合度影响,F10、F50、F70、F100各部分样品及Vc 的IC50值分别为0.91、 1.28、 1.37、 1.71和3.21 g/L,当质量浓度为4 g/L时F10、F50、F70、F1004部分以及Vc清除率分别为:93.54%、 81.34%、 79.83%、 77.54%、 52.33%,低聚体的抗氧化性高于高聚体的抗氧化性。

3.5 红外光谱分析经分级得到的各部分结构和原花青素标准品的结构基本一致。

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JIANG Qian1,ZHANG Jia-yan1,LEI Fu-hou2,LIU Zu-guang2

(1.Faculty of Material Engineering,Southwest Forestry College, Kunming 650224, China; 2.Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products,Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)

Isolation of cinnamon proanthocyanidins was performed on AB- 8 resin.1000 mg procyanidins raw materials were dissolved in small amount of 60% ethanol,then the concentrated solution was added to adsorption column in a constant rate.Ethanol solutions with volume fraction of 10%,50%,70%,100% were selected in gradient eluting by AB- 8 resin.The mass of F10that could be obtained from the ethanol 10% eluent was 290 mg;that of F50obtained from the ethanol 50% eluent was 150 mg; that of F70was 410 mg; that of F100was 80 mg.The sample with the highest purity in the four parts was F10, and its purity was 90.03%.The F100had the lowest purity in the four parts,and its purity was 42.11%.The eluting recovery achieved 93%.According to the analysis of polymerization degree and antioxidant activity,10%~50% ethanol eluent contained mainly oligomeric proanthocyanidins (OPC),70%~100% ethanol eluent contained polymeric proanthocyanidins (PPC).The antioxidative activity of 10% ethanol eluent was the highest.

proanthocyanidins;fractionation;antioxidative activity

联系地址:210042 南京市锁金五村16号中国林科院林产化学工业研究所电 话:(025)85482449,85482533联系人:谭卫红传 真:(025)85482450

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.01.005

2014- 08- 07

广西林产化学与工程重点实验室开放基金(GXFC12-04) 作者简介:姜 倩(1987— ),女,内蒙古牙克石人,硕士,研究方向为提取物化学与生物质化学品

TQ35

A

1673-5854(2015)01- 0026- 07

*通讯作者:张加研(1964—),男,四川乐山人,教授,博士,从事天然产物提取及加工方面的研究及教学;E-mail:245385416@qq.com。

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