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PFOS暴露对秀丽线虫寿长的影响及其与IIS相关基因的关联

2015-02-24武婧轩何德富

关键词:线虫存活率通路

李 丹, 武婧轩, 李 嘉,2, 何德富,2

(1. 华东师范大学 生态与环境科学学院,上海 200241;

2. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室,上海 200241)

PFOS暴露对秀丽线虫寿长的影响及其与IIS相关基因的关联

李丹1,武婧轩1,李嘉1,2,何德富1,2

(1. 华东师范大学 生态与环境科学学院,上海200241;

2. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室,上海200241)

摘要:以秀丽隐杆线虫(C.elegans)为模型,本文研究了全氟辛烷磺酸(PFOS)对机体寿长的影响及初步机理.结果显示0.2~200 μmol/L的PFOS暴露50 h导致野生型秀丽线虫寿长呈剂量依赖性缩短.在4类转基因线虫上,观察到Insulin/IGF-l.1信号通路(IIS)相关的daf-16、daf-2和age-1基因突变或敲除能影响线虫的寿长.进一步观察PFOS暴露导致4类转基因线虫的寿长变化率,并与野生型线虫比较.在CF1139和CF1580突变种上daf-16或daf-2的突变均未改变PFOS的缩短寿长效应.而在CF1295和TJ1052转基因型上发现daf-16b的基因敲除或age-1基因突变阻断PFOS的减寿效应.结果表明PFOS慢性暴露能加速动物衰老,缩短寿长.PFOS作用与IIS信号通路关系密切,daf-16b和age-1基因在其中起重要作用.

关键词:PFOS;秀丽隐杆线虫;寿长;Insulin/IGF-l.1信号通路;daf-16b;age-1

第一作者:李丹,女,硕士研究生,研究方向为环境污染与健康.

0引言

全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulphonate,PFOS)是重要的全氟有机化合物和主要代谢产物[1].因高表面活性和疏水疏油等特性,PFOS作为原料被大量用于表面防污剂、材料涂层、清洗剂、食品包装等各类工业及生活用品中[2].大量研究表明PFOS具有环境持久性和生物累积性,被认为是一种新型的持久性有机污染物.目前PFOS的污染足迹已遍布全球生态系统,并对生态环境和人类健康构成严重的威胁.虽然欧盟、美国、日本等发达国家已经限制了PFOS的使用,但目前世界上仍有许多国家生产和使用PFOS.

检测结果显示在大气、水、土壤、沉积物等多种环境介质中均已检测到PFOS存在.在我国沈阳市降雪中的PFOS浓度平均值范围在0.4~46.2 ng/L之间[3].长江三峡水域个别水域PFOS含量高于10 ng/L[4].美国6个城市中心废水中PFOS浓度为 0.04~5.29 μg/L[5].美国职业人群血液中PFOS的平均浓度为1046 μg/L,而非职业人群为 11.6 μg/L[6].PFOS可以通过食物摄入、空气吸入、皮肤吸收等多种途径进入机体[7],在人体血液中的半衰期长达5.4年[8].大量毒理学研究显示PFOS对肝、心脑血管、胚胎、生殖系统、神经系统等多部位产生毒性效应.如PFOS干扰正常的脂质代谢,对肝脏有氧化损伤作用[9];降低动物精细胞活力,减少精子数量,增加精子畸形率[10];PFOS延迟幼龄动物的生长发育,影响记忆功能[11].然而PFOS长期暴露是否能加速衰老,对动物的寿长产生影响尚未见报道.

秀丽线虫(C.elegans)是一种新型模式生物,具有适合衰老和寿长研究的多种优势.如个体小,生命周期短,繁殖能力强.超过40%基因与人类基因同源,因而相关结果可以外推到高等动物和人体,以评价环境污染物的健康风险.本文运用N2型秀丽线虫和4种基因缺陷型的转基因秀丽线虫进行PFOS的慢性暴露,观察和比较寿命长度的变化.研究目的是观察PFOS暴露对秀丽线虫寿长的影响,并分析其与胰岛素信号通路(Insulin/IGF-l.1 signaling pathway, IIS)相关基因的关系.

1材料与方法

1.1 模式生物与主要试剂

秀丽隐杆线虫(C.elegans)由国际线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center,CGC)提供.野生型为N2型秀丽线虫.基因缺陷型包括CF1139 [daf-16(mu86)Ⅰ; muIs61][12],CF1580 [daf-2(e1370)Ⅲ,muIs84][13],CF1295 [daf16bKO][13],和TJ1052 [age-1(hx546)Ⅱ][14].利用涂有大肠杆菌OP50的线虫培养基(nematodegrowthmedium,NGM)培养线虫,所有线虫均在20 ℃下恒温培养.

十七氟-1-辛烷磺酸钾购于美国西格玛公司,蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、叠氮化钠(NaN3)、DMSO均购于国药集团化学试剂有限公司,其他化学药品及试剂均为国产分析纯.

1.2 暴露方法

将PFOS溶解于DMSO中,配制成10mmol/L的储备液,用大肠杆菌OP50分别稀释至200μmol/L, 20μmol/L,2μmol/L,0.2μmol/L,助溶剂DMSO浓度小于1%.吸取50μL溶液,加于测定寿命用的NGM培养基六孔板上,每一个浓度设置3个平行样,记录其浓度与顺序.空白组吸取50μL大肠杆菌OP50溶液涂布.在室温中放置至干透,然后转到20 ℃恒温培养箱中培养,过夜后即可使用.暴露时选择同步化的L1期线虫,并持续暴露50h,完成一个生命周期.吸取50~100条线虫于一个PFOS暴露用板孔中,以少量水冲散抱团线虫,并保持培养基表面干燥,放入恒温培养箱中20 ℃培养.

1.3 寿长统计

PFOS暴露期结束后,将暴露的线虫转移到六孔板NGM培养皿,平均一个孔板转移30~40条为宜.此日记录为0d,放入恒温培养箱中20 ℃培养,并隔日记录线虫存活数.6d左右转移一次六孔板,防止杂菌对寿命产生影响.在转移过程中要注意丢失的线虫,或者爬到孔板壁上死亡的线虫,以及因为霉菌死亡的线虫,从最初的计数中排除[15].实验中,判断线虫死亡的标准为在低倍显微镜下,对机械刺激没有反应,于高倍显微镜观察下不进食.

1.4 统计学分析

实验数据均以平均值±标准误差(Mean±SE)表示.运用SPSS软件的单因素方差分析对各组数据进行显著性分析,以p<0.05 或p<0.01,表示差异显著.

2结果

2.1 PFOS慢性暴露导致野生型秀丽线虫寿长缩短

0.2、2、20、200μmol/LPFOS对N2型秀丽线虫暴露50h后,观察PFOS对线虫存活率和寿长的影响.结果显示PFOS暴露组存活率曲线均在对照组之下,呈浓度依赖性的渐次下降趋势(见图1A).进一步分析显示PFOS暴露导致线虫的平均寿长明显缩短,各暴露组较对照组均有显著性差异(见图1B).特别是200μmol/L高浓度暴露组,平均寿长较对照组降低了47.1%,最长寿命也较对照组降低了约30%(18.67dvs24d),反映PFOS较强的减寿效应.

2.2 IIS通路相关基因缺陷影响秀丽线虫寿长

本文进一步在秀丽线虫上观察IIS通路相关基因缺陷是否影响寿长.结果显示基因缺陷型CF1580、CF1295与CF1139线虫的存活率曲线均位于野生型N2线虫的下方;TJ1052基因缺陷型存活率曲线位于N2线虫上方(见图2A).统计分析得出CF1580、CF1295和CF1139线虫平均寿长较N2型显著性缩短,TJ1052型则显著延长(见图2B).群体最长寿命观察显示,TJ1052最长寿命为27.33d,比N2型长25%.而CF1580、CF1295和CF1139型线虫最长寿命均明显缩短.结果表明CF1580、CF1295和CF1139型线虫相关基因缺陷导致减寿效应,而TJ1052型线虫基因敲除导致增寿效应.

注:(A) PFOS暴露对秀丽线虫存活率的影响;(B) PFOS暴露对秀丽线虫平均寿长影响

注:(A)N2型和CF1580、CF1295、CF1139、CF1139基因缺陷型线虫存活率曲线;

2.3 PFOS慢性暴露对IIS通路相关基因缺陷型秀丽线虫寿长的影响

在IIS通路相关基因缺陷型CF1580、CF1295、CF1139、CF1139线虫上,进一步观察PFOS慢性暴露对寿长的影响效应.结果如图3所示,PFOS导致CF1580和CF1139线虫的存活率曲线均较对照组下移(见图3A,B),并呈一定的剂量依赖效应,其变化与在N2型秀丽线虫观察到的效应类似.统计结果显示PFOS导致CF1580和CF1139线虫的平均寿长均显著缩短(见图3E),这表明CF1580和CF1139线虫的相关基因缺陷未影响PFOS的缩短寿长的效应.而在CF1295和TJ1052基因缺陷型线虫上,则观察到不同的效应.同样梯度的PFOS暴露后,CF1295和TJ1052线虫的生存率曲线均与对照组部分重叠(见图3C和D),未见明显位移.统计显示2 μmol/L和20 μmol/L的PFOS暴露导致CF1295线虫平均寿长稍有降低,但与对照组未有显著性差异(见图3E).在TJ1052线虫上,3个PFOS暴露组平均寿长较对照均未见明显变化(见图3E).这表明CF1295和TJ1052线虫的相关基因缺陷明显影响PFOS的缩短寿长的效应.

在N2型和IIS通路相关基因缺陷型线虫上进一步分析0.2,2和20 μmol/L的PFOS暴露后线虫寿长变化率.结果如图3F,图中红色越深的部分表示变化率越高,即该品种对此浓度的PFOS暴露敏感,而色度越偏蓝则变化率越低,即该品种对此浓度的PFOS暴露不敏感.N2品种对于PFOS的暴露敏感程度最高,CF1580和CF1139线虫的敏感与N2基本一致,只是高浓度暴露组稍有下降.图中蓝色区域对应的CF1295与TJ1052两个品种则对PFOS暴露敏感程度低,寿长几乎不受PFOS暴露影响.

注:(a)-(d)PFOS暴露分别对CF1139型(a)、CF1580型(b)、CF1295型(c)和TJ1052型(d)线虫存活率的影响;

3讨论

作为新型持久性污染物,PFOS在生物体内的蓄积能力强于多氯联苯和有机氯农药等经典有机污染物[16],其可能的生态风险与健康危害引起了广泛关注.本文结果显示PFOS低浓度慢性暴露导致野生型秀丽线虫平均寿长和最长寿命均显著缩短,这表明PFOS较强的减寿效应.虽然PFOS的多种毒理学效应已有研究,其对动物寿长的影响尚属首次报道.本文暴露的最低效应浓度为0.2 μmol/L(107.4 μg/L),虽然比环境相关浓度高1—2个数量级.但考虑到PFOS在生物体内较强的聚积效应,如鱼类对PFOS的浓缩倍数为500~12 000倍[17].另外PFOS在人类血清中的半衰期长达5.4年[8].这表明本文使用的低浓度PFOS暴露导致动物衰老加快和寿长缩短,对机体健康具有明显的风险.

进一步研究显示daf-2突变的CF1580型、daf16b敲除的CF1295型,和daf-16突变的CF1139型线虫寿长显著缩短,age-1突变的TJ1052型线虫寿长则显著延长.以往研究显示Insulin/IGF-l.1信号通路的参与机体发育、代谢、生殖等多种功能[18,19].IIS通路上主要包括胰岛素受体daf-2基因、胰岛素受体底物IRS-1基因、哺乳动物PIK3同源基因age-1、转录因子daf-16、肿瘤抑制因子PTEN同源物daf-18基因等[19-21].本文研究与相关研究相互印证,表明IIS信号通路相关的age-1、daf-2、daf-16基因与新陈代谢、免疫及应激反应等多种功能调控有关,从而与线虫的寿长关系密切.

我们进一步观察PFOS暴露导致IIS信号通路相关基因突变型线虫寿长变化率,及其与野生型线虫上观察的差异.结果在CF1139和CF1580突变种上发现daf-16的突变或daf-2的突变均未改变PFOS的缩短寿长效应.而在CF1295和TJ1052转基因型上发现daf-16b的基因敲除或age-1基因突变能阻断PFOS对线虫的减寿效应.这表明DAF-16B和AGE-1蛋白在PFOS诱发线虫衰老加快和寿长缩短中起到重要作用.PFOS暴露影响动物衰老和寿长可能涉及到胰岛素信号、饮食限制和氧化损伤的多种因素,深入机制尚需进一步研究.

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(责任编辑张晶)

Effects of PFOS exposure on lifespan inC.elegansand their relations with IIS genes

LI Dan1,2,WU Jing-xuan1,2,LI Jia1,2,HE De-fu1,2

(1.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China;

2.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,

EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:Using a model of C.elegans, this study aims to investigate the effect of PFOS on the lifespan and its mechanisms. Results showed that 0.2~200 μmol/L PFOS shortened the lifespan of wild type wormsin a concentration-dependent manner after 50 h exposure.In four transgenic strains, mutation of daf-16, daf-2 and age-1 which are related to Insulin/IGFl.1pathway(IIS), could affect the lifespans of nematodes. We further observed lifespan change rates of the four transgene C.elegans after exposed to PFOS.Results showed that mutation of daf-16 or daf-2 did not alter PFOS-induced effects of shortening lifespan in CF1139 and CF1580 strain.However, knockout of daf-16b or mutation of age-1blocked PFOS-induced effects of shortening lifespan in CF1295 and TJ1052 strain. Our results suggested that PFOS could accelerate aging and shorten the lifespan of nematodes. PFOS-induced effects are closely relative with IIS signaling pathways, in which daf-16b and age-1 play important roles.

Key words:PFOS;C.elegans;lifespan;IIS signaling pathway;daf-16b;age-1

通信作者:何德富,男,博士,副教授,研究方向为毒理学、环境与健康等. E-mail: dfhe@des.ecnu.edu.cn.

基金项目:国家科技重大专项(2013ZX07310-001-04);上海市自然科学基金(11ZR1410500);河口海岸国家重点实验室开放课题(SKLEC-KF201311)

收稿日期:2014-09

中图分类号:X592

文献标识码:A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.013

文章编号:1000-5641(2015)02-0106-07

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