黑臭河道底泥细菌群落结构对人工曝气响应的DGGE分析

何　岩，　姚丽平，　李文超，　黄民生，　张一璠

(1. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室, 上海　200241；

2. 华东师范大学 生态与环境科学学院, 上海　200241)

黑臭河道底泥细菌群落结构对人工曝气响应的DGGE分析

何岩1,2，姚丽平1,2，李文超1,2，黄民生1,2，张一璠1,2

(1. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室, 上海200241；

2. 华东师范大学 生态与环境科学学院, 上海200241)

摘要：采用基于16S rDNA的PCR-DGGE (变性梯度凝胶电泳) 图谱并通过条带割胶回收DNA 进行序列分析，初步探讨了不同曝气条件下黑臭河道底泥中细菌群落结构多样性及其变化，同时用冗余分析(RDA)研究了环境因子与细菌群落结构之间的关系. 结果表明，人工曝气对黑臭河道底泥细菌群落结构产生明显的影响，并且随不同曝气强度底泥细菌群落多样性呈现不同的变化，其中当曝气扰动雷诺数(Re)为1810，溶解氧(DO)为7.35时，细菌优势群落多样性最高；序列比对分析推测适度的曝气有利于促进碳、氮、硫循环相关细菌的生长，其中以变形菌门为主导；冗余分析显示DO和Re对细菌群落结构影响显著.

关键词：黑臭河道;底泥;曝气;细菌;DGGE

第一作者：何岩，女，副教授，博士，研究方向为水环境治理与修复.E-mail: yhe@des.ecnu.edu.cn.

0引言

在外源污染有效控制后，底泥内源释放成为黑臭河道的重要污染源，其污染物的迁移转化行为是一个涉及化学、生物、物理等多种因素的多相的复杂的生物地球化学过程，其中微生物在这个过程中承担着重要角色[1]. 目前关于底泥污染物循环过程的微生物特性研究主要是针对海洋、河口海岸以及湖泊沉积物，对污染严重且受人为干扰频繁的黑臭河道底泥的相关研究较少，已有的研究分别是采用稀释平板法和最大或然数法研究河道底泥氮转化的细菌群落结抅[2]，以及用PCR-DGGE和克隆文库方法研究酸性河道厌氧底泥的微生物多样性[3]，但对于曝气修复条件下黑臭河道底泥细菌群落多样性及变化还尚未见报道. 本研究采用基于16S rDNA的PCR-DGGE图谱并结合条带割胶回收DNA 进行序列分析，初步探讨不同曝气条件下黑臭河道底泥中细菌群落结构多样性及其变化，同时用冗余分析(RDA)研究了环境因子与细菌群落结构之间的关系，为人工曝气治理黑臭河道工程的优化实施提供依据.

1材料与方法

1.1　样品来源

样品取自于底泥曝气修复模拟装置，装置内铺设底泥来自上海市普陀区一条重污染河道，通过调节曝气装置的转速来设定不同曝气强度的运行工况，具体可参见文献[4]中的报道. 不同曝气强度下，对应水体平均流速分别为0、0.247、0.288、0.320和0.372 m/s，雷诺数Re分别为0、1 311、1 810、2 133和1 736，DO分别为1.24、6.18、7.35、8.00和8.03 mg/L，分别记为Run0、Run1、Run2、Run3和Run4，其中Run0为对照组，无曝气，分别在每个工况运行初始(RunxS)和稳定(RunxE)时各采1次泥样(x代表不同工况)，装入无菌袋，并置于-80 ℃保存至分析.

1.2　基因组总DNA提取

河道底泥微生物基因组总DNA的提取采用TENP buffer/PBS buffer-Bead beating OMEGA土壤样品DNA抽提试剂盒(OMEGA 公司)组合方法，具体操作步骤参照徐欢[5]的方法，并将提取的基因组总DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测.

1.3　PCR扩增

以提取的基因组总DNA为模板，采用细菌的通用引物对968F(5′-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3′)/1401R(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′)对16 S rDNA的V6—V8区进行扩增，片段大小约为435 bp[6]. PCR反应体系为：PCR master mix 12.5 μL，正、反向引物各0.75 μL(浓度为10 μmol/L)，DNA模板 0.5 μL，适量的灭菌ddH2O补足到25μL；扩增反应条件为：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃∞. 将得到的PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测.

1.4　DGGE方法

基因组总DNA 16S rDNA V6—V8区扩增片段通过DGGE (Bio-Rad) 分离来研究细菌群落. 聚丙烯酰胺的变性梯度范围为40%～65% , DNA 扩增产物上样量为200 ng. 电泳条件为150 V , 60 ℃，420 min. 电泳完毕后经3*Gelred染色液染色45 min，用凝胶成像仪拍摄DGGE图谱并切胶. 切下来的代表性的条带加入30 μL 70%冷乙醇洗胶，把乙醇吸出并挥发干，然后加入25~30 μL超纯水，于4 ℃下24 h后再次PCR，将得到的PCR产物送入生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序.

1.5　冗余分析

将DGGE图谱经Quantity One软件分析后转化所得的条带信息矩阵，应用CANOCO 4.5软件进行除趋势对应分析(Detrended Correspondence Analysis，DCA)，结果显示可选用基于线性模型的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)研究细菌群落与环境因子的关系，然后采用前向选择(Forward Selection)，用蒙特卡罗置换检验(Monte Carlo permutation，Number of permutation 499)逐步找出显著影响(P<0.05)细菌群落变化的主要环境因子，再将生成的数据文件应用CanoDraw做出排序图.

2结果与讨论

2.1　不同曝气工况下细菌群落的多样性

图1为不同曝气工况下运行初期和稳定期黑臭河道底泥细菌的DGGE图谱. 由于样品中含量不低于1%的菌群才能在DGGE图谱中显示出来[7]，因此DGGE图谱中主要表达的是优势菌群信息. 通过Quantity One分析DGGE图谱中每个样品条带的位置和亮度，将其转化为数字化信息，用于评定细菌群落的多样性. 图2为不同曝气条件下运行初期和稳定期黑臭河道底泥细菌群落的Shannon多样性指数，各样品值处于2.66~3.19之间.

从图2可知，Run0、Run1和Run4运行稳定均较初始值有所降低，而Run2和Run3运行稳定比初始值均有明显提高，表明不同的曝气强度对底泥中的细菌优势菌群多样性产生了不同的影响，其中当曝气强度Re为1810，对应水体流速为0.288 m/s，DO为7.35 mg/L条件下，有利于提高黑臭河道底泥中的细菌优势群落多样性，这与观察到的最佳硝化-反硝化耦合性能相对应[4].

注：RunxS，运行初期；RunxE，稳定期；x，不同曝气工况；下同

图2　基于不同曝气工况运行初期和稳定期黑臭河道底泥细菌DGGE图谱的Shannon指数

2.2　不同曝气工况下细菌群落的变化

将DGGE图谱中的主要条带(B1—B12)割胶测序，得到的有效序列与Genbank中的序列进行比对，结果见表1. 不同曝气工况下细菌16S rDNA的序列比对表明，黑臭河道底泥中细菌大部分相似序列是不可培养的(Uncultured)，并且以厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌群. 厚壁菌门中的芽孢杆菌属(Bacillussp.)为好氧或兼性厌氧菌，对热和化学物质具有很强的抵抗力，并且在恶劣环境的长期刺激下，易产生次生代谢产物，会抑制其他类群的生长[8]. 厚壁菌门中的动性球菌属(Planococcussp.和Planomicrobiumsp.)可以作为陆源污染的一种指示类群，应用于近岸环境污染程度的监测[9,10]. 本研究所用的底泥样品来自重污染黑臭河道，符合Firmicutes的生长环境，这是重污染河道底泥细菌群落人为干扰的选择产物.

表1　基于细菌DGGE图谱测序条带的16S rDNA序列比对

通过对不同曝气工况下细菌群落的变化分析发现，在无曝气和低曝气强度条件下，条带B4和B5为优势条带，二者所代表的序列分别与多出现在污染严重的环境中的Bacillussp. MB12和Planomicrobiumsp.(均属于厚壁菌门)具有较高的相似性[11]，可据此分析该河道污染严重，对恶劣环境抵抗性较强的厚壁菌门含量较多. 随着曝气强度的增加，DO含量增加明显，大大的加快了污染物的迁移转化，厚壁菌门含量降低，变形菌门含量增加. 条带B10在工况2、3和4中具有较高亮度，经比对其与来自油砂尾矿池治理过程中参与碳和硫循环[12]的UnculturedGeobactersp.(属于Deltaproteobacteria)具有较高的相似性. 条带B12经比对其与来自生物膜的UnculturedAlcaligenessp.(属于Betaproteobacteria)具有较高的相似性，Betaproteobacteria是氮循环主要参与者，已有研究表明[4]Run2和Run3具有较高的氨氮和总氮去除率，推测该菌可能是底泥内源氮转化的主要参与者之一. 因此推断认为，适度的曝气可促进底泥中碳、氮和硫循环相关细菌的生长，从而有利于对底泥内源碳、氮和硫的控释. 后续有待通过相关功能基因的研究来进一步证实.

2.3　细菌多样性与环境因子的冗余分析

表2为基于DGGE图谱所得细菌优势群落与环境因子的冗余分析(RDA). 从表2可知，该排序图的前两个排序轴特征值分别为0.380和0.206，前两个排序轴共同解释了58.7%的细菌优势群落变化和67.0%的细菌优势群落—环境因子关系，物种与环境因子之间的相关系数分别为0.928和0.982. 4个排序轴总共解释了78.6%的细菌优势群落变化和89.8%的细菌优势群落—环境因子关系，说明该排序轴能较好地反映细菌优势群落演替与环境因子的关系.

表2　不同工况下细菌优势菌群演替的冗余分析(RDA)

3结论

底泥是河道污染物质地球化学循环的重要环节与界面，其中微生物在污染物转化过程中起着十分重要的作用. 本研究首次初步探讨了不同曝气条件下黑臭河道底泥中细菌群落结构多样性及其变化，发现曝气对底泥中的细菌优势群落多样性产生重要的影响作用，其中DO和Re是影响黑臭河道底泥细菌群落结构的主要因素. 初步推断适度的曝气可促进底泥中碳、氮和硫循环相关细菌的生长，其中当曝气强度Re为1 810，对应水体流速为0.288 m/s，DO为7.35 mg/L条件下，细菌优势群落多样性最高，并以变形菌门为主导. 建议后续开展相关功能基因的研究为人工曝气治理黑臭河道的优化实施提供更有力的依据.

[参考文献]

[1]何岩, 沈叔云, 黄民生, 等. 城市黑臭河道底泥内源氮硝化—反硝化作用研究[J]. 生态环境学报, 2012(6):1166- 1170.

[2]WU Q, ZHANG R, HUAN S, et al. Effects of bacteria on nitrogenand phosphorus release from river sediment [J]. Journal of Environmental Sciences-China, 2008, 20(4): 404-412.

[3]SANCHEZ-ANDREA I, RODRIGUEZ N, AMILS R, et al. Microbial diversity in anaerobic sediments at río tinto, a naturally acidic environment with a high heavy metal content[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(17):6085-6093.

[4]HEY, CHENY, ZHANGY, et al. Role of aerated turbulence in the fate of endogenous nitrogen from malodorous river sediments [J]. Environmental Engineering Science, 2013, 30(1): 11-16.

[5]徐欢. 水培植物净化槽对黑臭河水营养盐净化效果及其微生物机制研究[D]. 上海: 华东师范大学, 2012.

[6]HE Y, ZHAO Y C, ZHOU G M, et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from aged refuse for microbial community analysis[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2009, 25:2043-2051.

[7]MURRAY A E, HOLLIBUGH J T, ORREGO C. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(7): 2676-2680.

[8]ROMANENKOLA, TANAKA N, KALINOVSKAYA NI, et al. Diversity and antimicrobial activity of deep-sea surface sediment associated bacteria from the Sea of Japan [J].World Journal of and Microbiology and Biotechnology, 2013, 29:1169-1177.

[9]刘欣. 胶州湾沉积物细菌多样性及菌群时空分布规律研究[D]. 北京:中国科学院大学,2010 .

[10]FUJIOKA R S. Monitoring coastal marine waters for spore-forming bacteria of faecal and soilorigin to determine point from non-point source pollution [J]. Water Science & Technology, 2001, 44(7): 181-188.

[11]VELMURUGAN N, KALPANA D, CHO J Y, et al. Phylogenetic analysis of culturable marine bacteria in sediments from South Korean Yellow Sea[J]. Microbiology, 2011, 80 (2), 261-272.

[12]RAMOS-PADRON E, BORDENAVE S, LIN S, et al. Carbon and sulfur cycling by microbial communities in a gypsum-Treated oil sands tailings pond[J].Environmental Science & Technology, 2010, 45(2): 439-446.

(责任编辑张晶)

Responses of bacterial community structure in malodorous river sediments to aeration by DGGE

HE Yan1,2,YAO Li-ping1,2,LI Wen-chao1,2,

HUANG Min-sheng1,2,ZHANG Yi-fan1,2

(1.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,EastChina

NormalUniversity,Shanghai200241,China;

2.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:In this study, 16S rDNA based PCR amplification and denaturing gradientgel electrophoresis (PCR-DGGE) as well as sequence alignment from the excised DGGE bands were used to investigate the bacterial diversity and variation. In addition, the redundancy analysis was adopted to assess the relationship between bacterial community structure and environmental factors. The results showed that aeration had marked effects on bacterial community structure in malodorous river sediments and different aeration intensities resulted in variable bacterial community. Amongst them the highest richness of bacterial community was observed with the aeration turbulence of Re=1 810 and DO of 7.35. It was also inferred that moderate aeration facilitated the growths of related bacteria to N- and S-cycling and theProteobacteria was dominant. It was also found that DO and Re played important roles in bacterial community from river sediments.

Key words:malodorous river;sediments;aeration;bacteria;DGGE

通信作者：黄民生，男，教授，博士生导师，主要研究方向为水环境治理与修复技术、废水处理工艺与技术、环境微生物及应用技术. E-mail：mshuang@des.ecnu.edu.cn.

基金项目：国家自然科学基金(41101471、51278192、41001347);上海市科委社会发展重点项目(12231201900); 中央高校基本科研业务费专项资金资助;国家科技重大专项(2013ZX07310001、2014ZX07101012)

收稿日期：：2014-08

中图分类号：X522

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.010

文章编号：1000-5641(2015)02-0084-07