杭州西湖龙泓涧和北里湖水体及底泥毒性的生物学评价

杨永胜,　刘梦芸,　黄民生,　何德富

(1. 华东师范大学 生态与环境科学学院，上海　200241；

2. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室，上海　200241)

杭州西湖龙泓涧和北里湖水体及底泥毒性的生物学评价

杨永胜1,2,刘梦芸1,2,黄民生1,2,何德富1,2

(1. 华东师范大学 生态与环境科学学院，上海200241；

2. 华东师范大学 上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室，上海200241)

摘要：以青海弧菌(Vibrio Qinghaiensis)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和热带爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎为研究对象，检测分析了龙泓涧和北里湖的水体及底泥的可能毒性.结果发现，绝大部分水样和底泥提取液对3种实验对象均未产生明显毒性效应.部分水体和底泥反而呈现出一定的正效应，表现为增强青海弧菌的发光强度，促进热带爪蟾胚胎发育.极个别水样对青海弧菌和秀丽线虫显示毒性，引起爪蟾胚胎轻微致畸效应，可能与污染物排放等偶然因素有关.结果表明，龙泓涧和北里湖的水体及底泥呈现较低的生态风险，西湖水体具有相对高的生物安全性.

关键词：生物毒性；青海弧菌；秀丽隐杆线虫；热带爪蟾；西湖

第一作者：杨永胜，男，硕士研究生，研究方向为环境毒理学.

0引言

龙泓涧位于杭州西湖风景名胜区内，是西湖三条溪流之一和主要的天然补给水源.作为旅游景点，龙泓涧流域内居民生活、商业及农业活动所产生的各类污染物会通过地表径流进入龙泓涧流域，成为西湖主要的潜在外部污染源之一[1].龙泓涧水体质量好坏对西湖水质具有重要的影响.北里湖由于地理位置原因，一直以来是西湖水质的死角(见图1).西湖风景名胜区对于区域经济和社会的发展起着重要的作用，而且提供者巨大的生态服务功能.除了常规的理化监测之外，检测龙泓涧和北里湖水质的生态毒性对评价整个西湖的水体安全性具有前瞻性和代表性.

鱼类急性毒性实验、藻类生长抑制实验、水蚤类毒性实验以及鼠类毒性实验是较为传统的生物毒性测试方法[2].发光细菌作为一种新型快速毒性检测方法近年来得到广泛关注[3].秀丽隐杆线虫是一种新兴模式生物，被应用于生命科学的许多领域，在细胞分化、衰老、细胞凋亡、药物筛选和生态毒理等方面已经取得了重要进展[4].作为水生模式生物，热带爪蟾近年来常用于研究化学物质在生物体内的转移、解毒和作用机制[5]，并用于评价环境化学物对生物的影响及毒性作用[6]，近年来也被应用于评价水体生态毒性[7,8].

本研究选取青海弧菌、秀丽隐杆线虫和热带爪蟾胚胎作为实验对象，检测分析龙泓涧和北里湖水体及底泥的毒性，为该区域水质环境评价提供参考.

1材料与方法

1.1　材料

淡水发光细菌——青海弧菌Q67菌株(VibrioQinghaiQ67)由华东师范大学生命科学学院朱文杰教授提供.秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)由实验室自养，且取L1期的幼虫进行实验.热带爪蟾(Xenopustropicalis)由实验室自养，取NF10—11阶段且发育正常的胚胎用于实验.

1.2　样品的采集与制备

龙泓涧由主流与支流构成，成梯级分布，主流由五级塘组成，支流由四级塘组成.在主流源头及各个梯级塘出口各设一个采样点，共6个采样点(L1—L6).在支流各个梯级塘出口各设一个采样点，共4个采样点(L7—L10).北里湖位于西湖西北角，沿湖边共设置5个采样点(B1—B5)(见图1).于2013年11月18日和2014年5月13日各采集底泥一次.2013年11月采样时检测到龙泓涧和北里湖平均水温为9 ℃，龙泓涧流域水体清澈见底，pH值为8.50±0.85，DO(溶解氧)值为(13.25±2.23) mg·L-1.2014年5月份龙泓涧和北里湖平均水温为21 ℃，龙泓涧流域水体清澈见底，pH值为7.63±0.76，DO值为(7.69±1.28) mg·L-1；北里湖水体较清澈，DO值达到了(8.56±0.74) mg·L-1.将采集到的表层底泥装入密封袋中，在4 ℃下保存待用.将采集到的底泥与蒸馏水按质量比1∶3的比例混合后装入500 mL的锥形瓶中，密封于振荡机上振荡24 h，条件控制为100 r/min，22 ℃，然后静置24 h，提取上清液待用[8-10].于2014年5月13日采集水样1次，将采集到的水样密封于500 mL塑料瓶中4 ℃保存待用[11].

图1　西湖龙泓涧、北里湖采样点分布

1.3　实验方法

1.3.1青海弧菌急性毒性实验

将青海弧菌冻干粉于4 ℃下复苏10 min，加入5 mL 0.8%的NaCl溶液混匀，制成细菌悬液.先取3 mL的待测液加入试管中，然后每隔15 s(仪器测定每个样品大约需15 s，保证菌液与样品作用时间一样)依次加入60 μL的菌液混匀，15 min后用生物发光测定仪(9901LUMINOMETER型号)测定混合液的发光强度.每个样品设置3个平行管，每个样品再配一个对照管(0.8%的NaCl溶液).以每个样品对照管的检测值为空白组，按“抑光率I(%)=(IT空白-IT样品)/IT空白×100%”公式计算[7].阳性对照使用氯化锌，设置浓度为1、2、3、4、5和6 mg·L-1.氯化锌浓度与青海弧菌相对抑光率有较好的线性关系(见图2)，得出线性系数关系为：y=11.814x+27.2 (R2=0.974 3).通过参照物氯化锌对青海弧菌的剂量效应关系，可以进一步评价和判断水样对青海弧菌的急性毒性强弱.

1.3.2秀丽隐杆线虫毒性实验

依照通用的标准程序，野生N2型秀丽隐杆线虫培养在含有大肠杆菌OP50的琼脂培养基上.同步化到L1期的幼虫再进行毒性暴露实验.实验使用24孔板，每孔加入水样1 mL再加入0.01 mL OP50作为饲料，每孔分别加入20条同步化的L1期幼虫，每组设3个平行孔，对照组使用蒸馏水暴露，放置于20 ℃恒温培养箱中暴露48 h后在解剖镜下观察，用解剖针轻触虫体，没有任何反应的即视为死亡个体，记录死亡个体数目，计算死亡率[12].

图2　青海弧菌相对抑光率与氯化锌浓度线性图(均值±标准差，n=3)

1.3.3热带爪蟾胚胎致畸实验

挑选实验室养殖的性成熟热带爪蟾15对，采用注射绒毛膜促性腺激素(HCG)的方法诱导产卵[13].每对爪蟾各注射2次HCG(初次注射20单位,36 h后注射100单位)，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎.从产卵较好的3对蛙的胚胎中，挑选出达到NF10-11阶段且发育正常的胚胎进行实验[9].实验使用24孔板来进行暴露，实验组与对照组均设置4个平行，对照组使用Ringer溶液，每孔加入2.5 mL的水样及10只正常胚胎，在25 ℃多功能培养箱内进行暴露实验.24 h换液，记录孵化个数，并将未孵化的胚胎挑出，48 h统计死亡个数.将活着的胚胎用100 mg·L-1的MS-222麻醉处理后固定于70%的乙醇溶液中.取出固定的胚胎进行显微拍照，测量胚胎体长并统计畸形率.

2结果

2.1　龙泓涧、北里湖水体和底泥对青海弧菌的急性毒性

实验检测了2014年5月13日采集的水体和底泥提取液对青海弧菌的毒性效应.结果显示各采样点水体和底泥提取液对青海弧菌的相对抑光率几乎都是负值，只有L4点的水体是正值，表现为抑制作用(见表1).这表明龙泓涧和北里湖水体和底泥提取液对青海弧菌基本没有毒性，反而有促进细菌代谢的效应.另外，各底泥提取液导致青海弧菌发光强度的增强效应均高于水体，反映底泥具有更强的正效应.

2.2　龙泓涧、北里湖底泥提取液对秀丽线虫的毒性

实验将2013年11月18日采集的底泥提取液对秀丽隐杆线虫进行48 h暴露，以死亡率作为毒性指标.对照组和实验组的秀丽隐杆线虫死亡率大都为0，只有L5采样点底泥提取液致秀丽线虫死亡率显著性高于对照组(P<0.05)，其他采样点的致死亡率与对照组相比均没有统计学差异(见表2).

表1　龙泓涧、北里湖底泥提取液和水体致青海弧菌的相对抑光率

注： Results are expressed as percentages (means±SD,n=3).

表2　龙泓涧、北里湖底泥提取液致秀丽隐杆线虫死亡率

注： Results are expressed as means±SD，n=3,*P<0.05, compared to the control.

2.3　龙泓涧、北里湖水体和底泥对热带爪蟾胚胎的急性毒性

爪蟾胚胎分别暴露于2013年11月采集的底泥提取液和2014年5月采集的水样及底泥提取液，各处理组的爪蟾胚胎的发育和死亡率均未表现出明显的影响，与对照组相比没有统计学差异.以胚胎长为指标分析暴露后各组样品对爪蟾胚胎发育的影响，观察2014年5月水样(WS)的毒性，结果显示L4和L5点水样导致爪蟾胚胎发育被显著性抑制(P<0.001,与对照组相比)，其他水样均未抑制胚胎发育.另外，2014年5月收集的L4水样导致胚胎的畸形率显著升高，其他采样点则无明显影响(见表3).结果显示2013年11月采集的L6、L8、L9底泥对爪蟾胚胎发育表现出明显的促进作用，而2014年5月采集的L6底泥提取液则表现为抑制作用.两次采集的底泥中，只有2014年5月的L6样品提取液对爪蟾胚胎表现出较高的致畸率(P<0.001，与对照组相比)，而其他底泥提取液均未观察到明显的致畸效应.分析龙泓涧L6底泥和L4水样导致爪蟾胚胎的畸形表现，主要表型包括泄殖腔扩张、鳍变窄和脊索弯曲(见图3).

表3　龙泓涧和北里湖底泥提取液及水体对热带爪蟾胚胎发育的影响

注：SE1 and SE2 indicates respectively sediment extracts sampled in Nov, 2013 and in May, 2014. WS indicates water samples in May, 2014. Results are expressed as means±SD，n=3, *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001, compared to the control.

注：A—B，Effects of L6 sediment sample (May, 2014); C，Effects of L4 water sample (Nov, 2013)

3讨论

杭州西湖是世界文化遗产和著名旅游景区，其水环境质量和生态安全备受关注.基于化学和生态的地表水状况评估各有优势[14]，而生态毒理评价则能更好地分析生态系统的安全性.综合利用青海弧菌、秀丽线虫和爪蟾胚胎来评估龙泓涧和北里湖水体及底泥的生物毒性.结果表明，龙泓涧和北里湖底泥提取液和水样对青海弧菌基本没有毒性效应，反而表现出较强的促进作用.发光细菌法具有快速、灵敏、简便、成本低等优点，并能分析单因子，多因子或综合的环境污染物的毒性，受到广泛应用[15].使用的青海弧菌近年已在水质生物毒性检测方面大量应用[3,7,10,16,17].青海弧菌的发光强度受多种环境因子的影响，郑敬民等实验表明氮源、CaSO4、Mg2+、甘油等环境因子对青海弧菌生长发光有利[18].实验水样对青海弧菌没有出现发光抑制作用，反而较对照组的发光强度大幅提升.这可能与研究区域的水流源头在山区，致使与对照组相比水样中含有一定浓度的Ca2+、Mg2+和氮元素等，在这些有利因数的促进下青海弧菌的发光强度大幅提升.

作为一种模式生物，秀丽隐杆线虫已在生命科学等领域应用广泛，应用其检测水质生态毒性方面研究很少.本文使用短期暴露后的动物死亡率来表征样品的生物毒性，结果表明绝大部分底泥样品对线虫的存活均没有影响，死亡率接近为零.这表明该水域的底泥提取液对生活在土壤中的线虫基本没有生物毒性.水体样品和底泥提取液对热带爪蟾整体上没有产生生物毒性效应.甲状腺激素在爪蟾胚胎期起着重要作用，研究表明一些污染物能够通过影响胚胎的甲状腺激素信号而对胚胎的发育造成影响.部分采样点促进了爪蟾胚胎的生长可能与样品中存在促使甲状腺激素信号正效应的物质有关.龙泓涧L4的水样对爪蟾产生了明显的畸形效应，而该水样检测的青海弧菌发光强度也同样受到较大抑制(81.5%).我们推测这可能与龙泓涧流域部分茶农在涧中清洗施药设备等偶然因素有关，应引起一定的注意.

与以往在黑臭河道水体、工业废水和特定污染物上检测的生物毒性比较，本文运用青海弧菌和热带爪蟾胚胎表征的生物毒性强度要明显低[7,10,19-21]，这反映西湖水体水质总体良好.依托国家重大水专项，西湖龙泓涧流域和北里湖治理工程已实施完成.本文结果也反映这一项目的实施改善了西湖的水质.这与我国大沽排污河道生态修复后的生物毒性检测有类似之处，但从发光细菌检测值来看西湖水体生物毒性要远低于大沽河[22].另外，底泥提取液检测显示龙泓涧和北里湖底部毒性较低.河道底泥是水体污染物沉积的主要部位之一，其详尽的生物毒性还需结合整体沉积物毒性及主要污染物化学检测等方面进行深入分析.

综上所述，可以得知龙泓涧和北里湖水体及底泥提取液对青海弧菌、秀丽线虫和爪蟾胚胎基本无毒，反映西湖水体相对较低的生态风险.

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(责任编辑张晶)

Bioassay for toxicity of water and sediment in Longhong Ravine and Beili Lake in West Lake, Hangzhou

YANG Yong-sheng1,2,LIU Meng-yun1,2,HUANG Min-sheng1,2,HE De-fu1,2

(1.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China；

2.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,

EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:Using Vibrio Qinghaiensi, Caenorhabditis elegans and Xenopus tropicalis embryos, the potential toxicity of Longhong Ravine and Beili Lake were respectively detected. Results showed that water and sediments from Longhong Ravine and Beili Lake were not toxic to the three organisms. On the contrary, some samples showed positive effects, for example, enhanced luminous intensity of Vibrio Qinghaiensis and promoted the growth of Xenopus tropicalis embryos. A small number of samples caused slight teratogenic effects on Xenopus embryos, which were likely related to accidental discharges of pollutants. Our results suggested that Longhong Ravine and Beili Lake present relatively low ecological risks, which indicated high biological safety in West Lake.

Key words:biotoxicity;Vibrio Qinghaiensis;Caenorhabditis elegans;Xenopus tropicalis;West Lake

通信作者：何德富，男，博士，副教授，研究方向为毒理学、环境与健康等. E-mail: dfhe@des.ecnu.edu.cn.

基金项目：国家科技重大专项(2013ZX07310-001-04)

收稿日期：2014-09

中图分类号：X592

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.012

文章编号：1000-5641(2015)02-0098-08