基层监测采样问题的解决措施

尹子静，刘裕田

（山西省吕梁市动物疫病预防控制中心，山西吕梁 033000）

基层监测采样问题的解决措施

尹子静，刘裕田

（山西省吕梁市动物疫病预防控制中心，山西吕梁 033000）

采样监测是兽医实验室检测工作的基础，样品质量是否符合要求直接关系到检测结果的准确度，基层采样过程中存在着血清溶血、样品受污染、样品采集保存不规范等问题进行分析，建议使用负压采血管、严格采样规程等措施加以改进。

畜禽采样；问题；措施

采样监测是兽医实验室检测工作的基础，合格的样品才能得到科学的结论，为重大动物疫病防控、动物检疫和养殖场疫病净化提供可靠的诊断依据。由于我市地处吕梁山区，基层动物防疫工作者技术水平低，在监测采样中存在着诸多问题，下面就本人在兽医实验室检测工作中对基层采样存在的问题进行总结并提出改进方法，以供同仁参考。

1 在基层采样中存在的具体问题表现为

1.1 血清制备存在问题

血清学检测方法是兽医实验室工作中最基本的检测方法，而血清标本的质量是否符合要求直接影响到检测结果的准确度，因此血清的制备最为关键。血清是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体。在我市基层采集血清常见的问题如溶血、胶冻样血清等。溶血是由于各种原因造成红细胞破坏，胞内血红蛋白（Hb）等物质和细胞内液进入血清。制备血清过程中例如采血时在血肿的地方采集血样、血液注入采血管中时未取下针头或用力推出产生大量气泡、机械性强力振荡、突然低温冷冻或突然化冻都能引起溶血。溶血对ELISA检测法的影响主要是由红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。刘玉振等研究发现，溶血对HBsAg的检测有影响，当红细胞浓度＞25%造成的溶血可导致假阳性。由于基层采血未能普及含有分离胶及促凝剂的采血管，现场分离血清使得凝血时间不足，血清中的蛋白纤维未能完全分离，导致析出的血清在放置一段时间后呈现胶冻样（尤其是鸡猪血清最明显）。还有可能是脂浊血清，出现的原因脂肪堆积过多，或血清离心不合适（时间、速度等因素），导致分离出的血清中存在着脂质小粒，这些小粒容易附着在酶标板内壁，非离子洗涤剂对这些物资洗涤不彻底，造成非特异型吸附使得吸光值偏高而造成假阳性结果。吴泽馨研究表明，脂浊标本对ELISA法检测乙型肝炎表面抗原实验结果干扰较大，极易容易形成假阳性结果，严重影响测定结果的正确度。

1.2 缺乏无菌概念，样品污染严重

在采集猪、鸡血液过程中容易扎破血管，导致流出血管外的血液受污染。由于血清受到细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，以HRP为标记的ELISA测定中，会产生假阳性反应。

1.3 病原学采样不规范

病原学可以从疫病的病原、流行病学、分子生物学和免疫学等角度，深入揭示重要动物疫病病原的变异规律、流行特点、致病机制及机体免疫保护机制，为动物疫病的监测、预警及防控提供技术支持。随着生物学研究由宏观领域向微观领域的发展，病原体检测方法也从组织形态学水平深入到分子水平、基因水平。例如高致病性禽流感鼻咽拭子采样是病原学监测中的一个重要环节，操作简单，但是基层采样过程中存在采样器具不合格、受污染、采样部位、样品保存液种类、保存方法不正确等问题，使得病原学监测结果受到影响，浪费了大量的人力、物力、财力。样品采集的时间、部位及采集质量对病毒分离、提取以及制备有活性的RNA至关重要，而样本保存与运输不当，也会影响病毒的分离。

1.4 样品盛放容器标准不一，加大实验室检测人员工作量

采集血清时，由于各县市区采样的采样器具不统一，分别为兽用采血器、真空管、注射器等，造成检测过程中吸取血清困难，严重影响实验室检测效率。

1.5 采样单填写简单，难以准确研判检测结果并评估免疫结果

由于基层防疫人员文化水平低、年龄老化，采样单填写简单，比如未能按照要求写清楚畜禽种类、日龄、代次、免疫程序、免疫时间、疫苗种类、疫苗生产厂家及批号。由于现代疫苗技术发展，特异性的检测试剂盒成为动物防疫工作研究者的重点。例如薛双等研究证实，猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体的检测不能使用IHA试剂盒检测，猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体ELISA诊断试剂盒（VP1-ELISA）和口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（LB-ELISA）都可以用来评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后血清抗体水平，这和陈方志等试验结果相同。

1.6 采血技术不规范、不熟练

直接导致畜禽应激反应大，造成畜主对采样工作不支持。由于基层兽医站人员部分为“三定”时期的人员，牛羊鸡采样使用“采血针+负压管”尚未普及，以及猪前腔静脉采样法使用较少，造成采血时动物应激反应大，畜主对采血有抵触情绪。

1.7 样品采集数量少

不足以代表整个养殖场的抗体水平。根据统计学一般规律，采样量达20头时可信度达98%，达30头时可信度达99%，达40头时可信度达99.5%，达50头时可信度达99.9%。因此建议每个阶段分别至少采样30头。考虑到种公猪的特殊重要性，最好每头种公猪都要采样。

1.8 忽视样品保存的时效性

对于市县乡三级动物防疫部门来说，由于集中监测的时效性和区域性，从乡镇兽医站组织采血到市级兽医实验室开展检测需要5个工作日以上，因此存在着在夏季血清样品冷藏容易腐败、抗体效价降低以及细菌滋生等问题。由于血清在冰箱中长时间保存导致血清IgG聚合，使间接法ELISA的试剂本底加深。冷冻血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均。

2 原因分析及解决措施

2.1 采血前基层防疫人员提前告知养殖户，相互配合，尽量在采血前12h减少饲喂饲料，多饮水。

2.2 普及使用真空负压管采血技术，严格无菌采血。只要是扎破血管流出血管外的血液不能采集，因为血液已经受到污染。制备血清的过程中有条件的话尽量在无菌操作台制备血清，也可加入适当防腐剂。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。

2.3 制定血清制备标准操作规程。采血完成后，迅速将采血器倾斜30度左右放入37℃恒温箱2h以上（冬季北方天气温度低，采集鸡血清时候要带热水袋，加快血液凝集进程），拿出后在冰箱4℃放置过夜，用3000转/min离心10min分离血清。一般说来，在5d内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需-20℃保存。

2.4 采集的样品用防水油性记号笔标记要清楚，编号要有规律，样品的排列要有顺序，以便于检测、统计结果。采集的样品要有详细的说明，包括畜禽的健康状况、日龄、胎龄、种类、免疫程序、近3个月的免疫时间、疫苗种类和疫苗来源等数据。

2.5 病原学所有标本的收集、运输和保藏都应装在有螺旋盖的塑料管中，以防止开、关标本管时产生气溶胶，并用两层封口袋包裹严实，不同场（村）不能混装，同时注意采样过程中器械交叉污染。采集样品要装在有冰袋的保温盒内及时送达实验室，运送途中尽量避免摇晃，以免溶血。采样的鼻咽拭子WHO及美国CDC规定，鼻咽拭子采集只能用塑料杆的涤纶或人造棉拭子（如常用的聚酯纤维拭子），不能用藻酸钙拭子或木杆拭子，因可能使某些病毒失活或抑制PCR，脱脂棉含有荧光物质，影响实时应荧光定量PCR结果。

2.6 加强基层动物防疫人员采样技术培训。通过组织骨干现场示范、防疫人员现场实践等方式举办实验室技术培训以及技术比武，同时发放自制的采样视频音像资料以期提高技术水平。

[1]刘玉振，等.溶血对抗-HCV、HBsAg等测定结果的影响.中国输血杂志[J].1999，12（1）:32-33.

[2]吴泽馨，等.脂浊标本对ELISA法检测乙型肝炎表面抗原结果的影响.内蒙古中医药[J].2012（17）:107-108.

[3]薛双，等.不同方法检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体的对比试验[J].兽医导刊，2012（07）:68-69.

[4]陈方志，等.猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗体水平检测.动物医学进展[J].2009（08期）:116-118.

[5]人感染H7N9禽流感病毒标本采集及运送技术规范.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．11.008

尹子静（1963～），山西省兴县人，主要从事动物疫病防治工作