支气管哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA的表达及作用机制研究

汤　菲，王缚鲲，安黎云，贾克然

(解放军白求恩国际和平医院 检验科，河北 石家庄050082)

支气管哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA的表达及作用机制研究

汤菲，王缚鲲，安黎云，贾克然

(解放军白求恩国际和平医院 检验科，河北 石家庄050082)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0578)

支气管哮喘作为呼吸道常见的慢性疾病，是一种由多种炎性细胞参与的气道慢性变应性炎症性疾病，其发病率呈逐渐升高的趋势，严重地影响患者的健康。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3(Tim-3)作为Tim基因家族的成员，是一种T细胞功能相关的表面分子，可在Th1细胞表面选择性地表达的同时参与Th2的免疫应答反应而增加IFN-γ水平，以缓解病情[1]。本研究通过逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测支气管哮喘患者诱导痰炎性细胞中的Tim-3 mRNA水平，并分析其与IL-4及IFN-γ的关系，从而探讨在支气管哮喘的发生发展中Tim-3的作用。

1资料与方法

1.1　一般资料

选择2012年5月-2013年8月我院呼吸门诊收治的81例支气管哮喘患者为研究对象，按照病情进展将其分为哮喘缓解组和哮喘发作组，其中哮喘缓解组36例，男21例，女15例；年龄21-65岁，平均(36.4±15.2)岁，病程3个月-13年，平均(3.5±1.2)年；哮喘发作组(包括轻度至中度急性发作期)45例，男26例，女19例；年龄20-67岁，平均(37.3±14.9)岁，病程2个月-14年，平均(3.9±1.0)年。纳入标准：①患者符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组关于支气管哮喘的诊断标准[2]；②患者不合并有其他肺部疾病如肺炎等；③患者在试验前的1个月内没有出现上呼吸道的感染症状；④患者近半年内无肌注糖皮质激素史；⑤符合医学伦理学要求；⑥患者及家属知情同意，并签署知情同意书者。排除标准：①孕产妇、哺乳期妇女；②合并有心功能不全者；③合并有肝、肾功能障碍者；④有吸烟史的患者。同期随机抽取120例来我院体检的健康体检者为对照组，其中男72例，女48例，年龄22-69岁，平均(36.9±14.8)岁。三组对象基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2　支气管哮喘诱导痰的收集及处理

诱导痰的收集：在收集诱导痰之前，采用超声雾化器对试验对象雾化15 min，雾化剂选择浓度为3%的高渗盐水；然后试验对象用清水漱口并将唾液完全吐出，直到咳出痰液为止，收集痰液至消毒平皿中。如果痰液量不足，则采用浓度为4%的高渗盐水进行雾化直到收集到适量的痰液。最后将收集的痰液置于4℃环境下保存，以备处理。诱导痰的处理：根据收集到痰液的质量，将透明且密度较高的痰液部分放入到事先准备好的已经称重的EP试管中进行称重，同时在试管中加入4倍体积、浓度为0.1%二流苏糖醇(DTT)，振荡10 min，从而使痰液和DTT充分混合，摇匀后将其置于37℃水浴中10分钟，然后通过200目筛网过滤掉杂质部分，最后采用血细胞计数盘计算细胞的总数量。诱导痰以2 500 r/min转速离心10分钟后，将上清液置于-80℃的冰箱中保存以待后用。沉淀的细胞通过RT-PCR技术检测诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA的水平。

1.3　采用 RT-PCR技术检测Tim-3 mRNA水平

根据说明书，采用Trizol法提取炎性细胞中的总RNA，然后在逆转录的作用下合成cRNA(逆转录试剂盒由Promega公司提供)，最后通过PCR技术进行扩增产物(PCR试剂盒由天根生化科技有限公司提供)，并将扩增的产物置于-80℃条件下保存以待后用。PCR引物序列由Premier Primer 5.0 引物设计软件设计得到，Tim-3引物序列：上游5’-AATTGAACTGGGACCTGCAC-3’,下游5’-CTTTCACCTCAGCACCCAGT-3’，产物的大小为233 bp， 退火温度为68℃，其中Tim-3 的内参照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。扩增的条件设定为：95℃下预变性3分钟，95℃下变性10秒，同时退火延伸10秒，再重复40个循环。每份标本均通过PT-PCR技术采用GAPDH和Tim-3 的引物来进行荧光定量分析，重复3次后取平均值。

1.4　酶联免疫测定法(ELISA)测定IL-4、IFN-γ

将收集的痰上清液采用ELISA严格按照说明书检测各组的IL-4、IFN-γ(深圳达科为生物工程有限公司提供ELISA试剂盒)。

1.5　肺通气功能检查

试验对象在安静的环境下休息30分钟后，采用肺功能测定仪分别测量各组对象的1s用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)和FEV1/FVC×100%。

1.6　统计学处理

2结果

2.1　三组对象肺通气功能及Tim-3 mRNA水平比较

三组对象的FEV1、FVC和FEV1/FVC水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较，哮喘发作组和哮喘缓解组的FEV1、FVC和FEV1/FVC水平均低于对照组，哮喘发作组低于哮喘缓解组；三组对象的Tim-3mRNA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，哮喘发作组、哮喘缓解组的Tim-3mRNA水平高于对照组，且哮喘发作组高于哮喘缓解组,见表1。

组别nFEV1(L)FVC(L)FEV1/FVC(%)Tim-3哮喘缓解组363.51±0.65Δ4.15±0.49Δ76.15±3.17Δ0.25±0.02Δ哮喘发作组452.60±0.59Δ※3.38±0.51Δ※64.82±3.05Δ※0.39±0.04Δ※对照组1204.02±0.614.73±0.5187.33±2.940.11±0.02F值8.6329.18512.1878.571P值0.0340.0290.0010.036

注：Δ表示与健康对照组比较，P<0.05，※表示与哮喘缓解组比较，P<0.05。

2.2　三组对象痰上清液中IL-4、IFN-γ水平比较

三组对象的IL-4、IFN-γ水平经方差分析，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较，哮喘发作组和哮喘缓解组的IL-4水平高于对照组，哮喘发作组高于哮喘缓解组，并且哮喘发作组和哮喘缓解组的IFN-γ水平低于对照组，哮喘发作组低于哮喘缓解组，见表2。

2.3　Tim-3 mRNA与IL-4、IFN-γ及FEV1/FVC的相关性分析

哮喘缓解组的Tim-3 mRNA与IL-4具有正相关关系(r=0.71，P<0.05)，与IFN-γ和FEV1/FVC有负相关关系(r=-0.86、-0.81，P<0.05)；哮喘发作组的Tim-3 mRNA与IL-4有正相关关系(r=0.65，P<0.05)，与IFN-γ和FEV1/FVC有负相关关系(r=-0.77、-0.78，P<0.05)，见表3、表4。

表2　三组对象诱导痰的上清液中IL-4、IFN-γ水平

注：※与健康对照组比较，P<0.05，Δ与哮喘缓解组比较，P<0.05。

表3　哮喘缓解组Tim-3 mRNA与IL-4、IFN-γ

表4　哮喘发作组Tim-3 mRNA与IL-4、IFN-γ

3讨论

支气管哮喘作为临床常见的气道慢性炎症性疾病，主要是在炎性细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞以及气道结构细胞如气道平滑肌细胞和细胞组分等的参与下发生[3]。现有的病理生理学机制认为，支气管哮喘的发生主要与Th1和Th2细胞亚群的功能失衡有关，支气管哮喘的免疫反应主要以Th2型应答为主。目前相关的研究表明，增强Th1细胞的分化功能可以有效地抑制支气管哮喘以及其他相关的变态反应性疾病的进程，而增强Th2细胞的分化功能则可以抑制自身免疫性疾病的进展[4]。因此，通过调节Th1和Th2细胞表面分子中免疫调节治疗的靶分子可以改善Th1/Th2的失衡状态，使其恢复平衡[5]。Tim-3 是Tim家族中新近发现的一种与T细胞功能有关的表面分子，它可以在小鼠体内的Th1中优先表达，并且Tim-3和配体通过作用可以负调节Th1细胞介导的免疫应答[6]。因此，临床上可通过Tim-3抗体来阻断Tim-3的表达，增强Th1的免疫应答反应来抑制Th2的表达，并最终控制相关疾病的发生及发展。诱导痰作为一种安全、有效且重复性较好的实验标本，通过检测诱导痰中炎性细胞的计数可以准确地反映气道的炎症性反应。

Th1/Th2细胞的功能失衡导致支气管哮喘的发生，但是关于Tim-3在支气管哮喘患者Th1/Th2细胞失衡中的机制相关的研究还较少。本研究显示，哮喘发作组、哮喘缓解组的FEV1、FVC和FEV1/FVC均低于对照组，并且哮喘发作组低于哮喘缓解组，说明支气管哮喘患者存在不同程度的气道阻塞，与有关研究结果一致[7]。结果还显示，哮喘发作组和哮喘缓解组的Tim-3/β-actin高于对照组，并且哮喘发作组高于哮喘缓解组，说明Tim-3 在哮喘发作期具有一定的作用，提示我们可通过检测Tim-3来预测疾病的发生及发展过程。

有研究表明，通过检测IFN-γ和IL-4的变化可以有效的反映Th1/Th2的免疫应答状态[8]。本研究发现，哮喘发作组、哮喘缓解组的IFN-γ水平低于对照组，且哮喘发作组低于哮喘缓解组，哮喘发作组和哮喘缓解组的IL-4水平高于对照组，且哮喘发作组高于哮喘缓解组，说明支气管哮喘患者中Th2细胞因子表达增强，而Th1细胞因子表达相对减弱，Th1/Th2细胞免疫失衡，与有关研究结果一致[9]。本研究通过分析Tim-3 mRNA与IL-4、IFN-γ和FEV1/FVC的相关关系发现，哮喘发作组和哮喘缓解组的Tim-3 mRNA与IL-4成正相关，相关系数分别为0.71、0.65，与IFN-γ成负相关，r分别为-0.86、-0.77，与FEV1/FVC成负相关，r分别为-0.77，-0.78。结果提示，我们通过检测Tim-3可以反映支气管哮喘的严重程度，在临床有重要的参考意义。

参考文献：

[1]Li Z,Ju Z,Frieri M.The T-cell immunoglobulin and mucin domain(Tim)gene family in asthma,allergy,and autoimmunity[J].Allergy Asthma Proc,2013,34(1):e21.

[2]中华医学会呼吸分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2003,26(3):132.

[3]吴迪,王珂.支气管哮喘治疗现状及进展[J].医学综述,2013,19(4):664.

[4]Yu W,Du H,Fu Q,et al.The influence of Th1/Th2 and CD4+ regulatory t cells of mesenteric lymph nodes on systemic lipopolysaccharide[J].Pol J Pathol,2014,65(2):125.

[5]Wang J,Jin RG,Xiao L,et al.Anti-asthma effects of synthetic salidroside through regulation of Th1/Th2 balance[J].Chin J Nat Med,2014,12(7):500.

[6]刘津麟,刘东升,李冬宏,等.人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达[J].现代生物医学进展,2011,11(18):3427.

[7]梁秀云,蒙春华,莫城航,等.支气管哮喘患者血清IL-4、YNF-a及IgE水平变化及临床意义[J].现代生物医学进展,2012,12(20):3864-3866,3884.

[8]尹德锋,熊瑛.IL-4、IFN-γ和TGF-β1在支气管哮喘发病过程中的作用[J].临床合理用药,2014,7(6):161.

[9]唐丹,梁萍,苏培媛.支气管哮喘患儿Th1/Th2细胞免疫平衡变化研究[J].中国医药科学,2011,1(10):43.

摘要：目的探讨支气管哮喘患者诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA的表达及作用机制，并分析其与上清液中IL-4、IFN-γ和肺功能指标的相关性。方法将2012年5月-2013年8月我院收治的支气管哮喘患者分为哮喘缓解组和哮喘发作组，并于同期随机选取120例健康体检者为对照组，通过逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测三组的诱导痰炎性细胞中Tim-3 mRNA的水平，同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中IL-4、IFN-γ，分析其与Tim-3 mRNA的相关性。结果哮喘发作组、哮喘缓解组FEV1、FVC、FEV1/FVC低于对照组，哮喘发作组低于哮喘缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)，哮喘发作组、哮喘缓解组的Tim-3/β-actin水平高于健康对照组，且哮喘发作组高于哮喘缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)；哮喘发作组、哮喘缓解组IL-4高于健康对照组，哮喘发作组高于哮喘缓解组，哮喘发作组、哮喘缓解组IFN-γ低于健康对照组，哮喘发作组低于哮喘缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)；哮喘缓解组Tim-3 mRNA与IL-4有正相关关系(r=0.71，P<0.05)，与IFN-γ和FEV1/FVC有负相关关系(r=-0.86、-0.81，P<0.05)，哮喘发作组Tim-3 mRNA与IL-4有正相关关系(r=0.65，P<0.05)，与IFN-γ和FEV1/FVC有负相关关系(r=-0.77、-0.78，P<0.05)。结论通过检测Tim-3 mRNA水平可以有效评估支气管哮喘的发生与发展，临床有重要参考价值。

关键词：支气管哮喘；诱导痰；炎性细胞；Tim-3 mRNA

Expression and mechanism of Tim-3 mRNA of inflammatory cells in induced sputum of patients with bronchial asthmaTANGFei，WANGFu-kun，ANLi-yun，etal.(Departmentofclinicallaboratory,Thepeople'sLiberationArmyHepingHospitalBethuneInternational,Shijiazhuang050082,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and mechanism of inflammatory cells in induced sputum of patients with bronchial asthma and the correlation between IL-4 and IFN-γ in supernatant.MethodsThe patients with bronchial asthma in our hospital from 2012 May to 2013 August were divide into asthma remission group and asthma group,and 120 of health volunteers as control group were randomly selected in the same period.The Tim-3 mRNA of inflammatory cells in induced sputum was detected by RT-PCR,and the IL-4、IFN-γ were detected by ELISA,and the correlation was analyzed.ResultsThe FEV1、FVC、FEV1/FVC of asthmatic group and asthma remission group were lower than those of control group when its were lower than those in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05),Tim-3/β-actin of asthmatic group and asthma remission group were higher than that of control group when it was higher than that in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05);The IL-4 of asthmatic group and asthma remission group were higher than those of control group when its were higher than those in asthma remission group,The IFN-γ of asthmatic group and asthma remission group was lower than that of control group when it was lower than that in asthma remission group,the difference was statistically significant(P<0.05);There was a positive correlation between Tim-3 mRNA and IL-4(r=0.71，P<0.05) in asthma remission group when a negative correlative with IFN-γ and FEV1/FVC(r=-0.86、-0.81，P<0.05)，and there was a positive correlation between Tim-3 mRNA and IL-4(r=0.65，P<0.05) in asthmatic group when a negative correlative with IFN-γ and FEV1/FVC(r=-0.77、-0.78，P<0.05).ConclusionDetecting Tim-3 mRNA can effectively evaluate the occurrence and development of bronchial asthma,and it has an important reference value in clinical.

Key words:Bronchial asthma;Induced sputum;Inflammatory cells;Tim-3 mRNA

收稿日期：(2014-03-27)

文献标识码：A

中图分类号：R562.2+5

文章编号：1007-4287(2015)04-0578-04