利巴韦林对hep-2细胞的放疗增敏作用观察

2015-02-24朱飞,李鸿燕,赵明等

中国实验诊断学 2015年1期

朱飞,李鸿燕,赵明,陈鸥*

(吉林大学第二医院,吉林长春130041)

近年来喉癌的治疗越来越注意保留喉功能，放射治疗的重要性逐渐增加[1],而放疗抵抗则是难以回避的问题，放疗增敏成为新的任务。很多人类肿瘤组织尤其是喉癌中发现了翻译起始因子4E(eIF4E)，它的过度表达被认为和疾病进展密切相关[2]，可以作为放疗增敏的新靶点[3]。利巴韦林是一种广泛应用的抗病毒药物，在现今临床实验中被发现可以抑制eif4e[4]。本文是以人喉癌细胞系 Hep-2 为对象，研究利巴韦林对其放疗敏感性的影响，以初步探究利巴韦林能否作为一种新的放疗增敏药物。

1材料与方法

1.1　细胞株

人喉癌细胞系 Hep-2，由吉林大学第二医院耳鼻喉科实验室提供，复苏后传代培养。

1.2　药物、试剂及仪器

注射用利巴韦林，粉剂，0.25 g一支，品牌名为奇力清。

RPMI-1640 培养基、PBS缓冲液、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自hyclone公司；碘化丙锭(PI )及 AnnexinV-FITC 试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司X线治疗机由吉大二院放疗科提供；流式细胞仪由吉大二院中心实验室提供。

1.3　试验方法

1.3.1细胞培养人喉癌细胞 Hep-2 置于含 10% 胎牛血清 RPMI-1640 培养液中贴壁培养，于 37℃ 5%CO2孵箱中孵育，常规传代换液。

1.3.2细胞分组取对数期生长的 Hep-2细胞按 1 ×105个/ml胞接种于A、B 2个 6孔培养板，A板对照组，B板放疗组，每个板4个孔，37℃ 5% CO2孵箱中孵育 24 h。换液后加入加入利巴韦林PBS溶液，使AB两板各孔利巴韦林浓度依次为：0 mg/L，2 mg/L，4 mg/L，8 mg/L，放入孵箱孵育24H。B 板室温下6MV-X 线单次照射，照射条件为：源皮距(SSD) 75 cm，照射野为12.5×8.5 cm，A板不予照射，换液后两板继续孵育24H。

1.3.3消化收集细胞前观察显微镜下AB两板细胞形态变化。

1.3.4收集细胞及流式细胞检测凋亡。以胰蛋白酶消化收集细胞，并以冷PBS清洗2遍，800 r/min离心8 min，弃去上清。遵细胞凋亡检测试剂盒说明，以1 ml1Xbuffer重悬细胞，300 g离心3 min，弃去上清后加入1 ml1Xbuffer重悬细胞。然后取其100 μl细胞加入标记好的EP管，加入AnnexinV-FITC 及PI 5 μl避光孵育15 min，加入PBS至500 μl后混匀细胞；400 目筛网滤过后上机分析。流式细胞仪散点图中AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，即C4象限。以C4象限细胞比率记录为各组细胞的凋亡率。

1.3.5重复实验3次，结果取均值。

1.4　数据分析

实验所得数据应用 SPSS16.0软件进行分析，假设检验的显著性水平取α=0.05。

2结果

2.1A组各孔细胞贴壁生长尚可，细胞多数呈梭形或多角形，形态及大小尚均一，生长致密，偶有悬浮颗粒。B组各孔细胞形态不均，部分细胞变大，间距稀疏，可见核碎裂象，悬浮颗粒较多(图1)。

A组B组

图120倍光镜下各培养板细胞形态

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡结果见表1。

表1　各孔细胞凋亡率比较

A组间4孔比较差异不明显(P>0.05)。AB组各孔比较差异显著(P<0.05)。B组组间其他各孔凋亡率同(7.45.0±0.45)%比较，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随着利巴韦林浓度升高，hep-2细胞凋亡增加。见图2。

A组流式细胞图

B组流式细胞图

3讨论

喉癌是喉部常见的恶性肿瘤，主要为鳞癌，好发于声门或声门上区，在耳鼻咽喉恶性肿瘤中占11%-22%[5]。近年来，喉癌的治疗对保留喉功能愈发重视，放射治疗的地位愈加重要。但喉癌对放疗敏感性低，常出现对放疗不敏感导致放疗抵抗，或者大剂量放射治疗后引发喉软骨炎、喉水肿、喉软骨坏死等不良反应[6]，因此需要新的策略提高喉癌的放疗敏感性。寻找高效安全的放疗增敏剂是放疗增敏研究的新热点。理想的放射增敏剂应能显著增加肿瘤细胞的放疗疗效，而对正常组织没有或很小有毒副反应[7]。

研究表明，真核细胞翻译起始因子eiF4e可以作为放疗增敏的一个靶点[8]。eIF4e在喉癌组织中高表达，显著地改变了细胞表型，可促进细胞增殖和诱导细胞转化、肿瘤形成和转移，影响VEGF及bFGF表达，影响肿瘤血管生成[9]。利巴韦林是目前临床实验中eiF4e的直接抑制剂，在急性髓系白血病的相关研究中发现能抑制M4和M5型AML致癌基因的表达[10]。利巴韦林又名病毒唑、三氮唑核苷，是广谱强效的抗病毒药物，目前广泛应用于病毒性疾病的防治，是一种安全的临床药物。是以本实验以人喉癌细胞系 Hep-2 为对象，研究利巴韦林对其放疗敏感性的影响，以初步探究利巴韦林能否作为一种新的放疗增敏药物。本实验中A组各孔未经放射治疗，虽有不同浓度的利巴韦林作用，但检测凋亡并无明显差异，说明利巴韦林单纯作用并不能明显诱导细胞凋亡。B组中利巴韦林0mg/L的孔，可作为单纯放疗看待。B组中其他各孔与其相比，凋亡率随着利巴韦林浓度的提高而上升。说明利巴韦林确实能够起到对hep-2细胞的放疗增敏作用，并且随着剂量的提高作用更明显。表明利巴韦林有可能在不增加放射剂量的前提下，增加放疗效果，减少放射带来的各种不良反应，从而有可能进一步提高喉癌的治愈率，降低转移率，降低放疗的不良反应。

肿瘤放疗的靶向增敏还可以有包括基因治疗联合放射治疗、生物制剂联合放射治疗以及基于乏氧理论的多维适形放射治疗等[11]，已有信号传导及转录活化因子3反义寡核苷酸基因治疗联合放疗的研究[12]。利巴韦林与其相比，优点在于安全和简便。但其作用的分子机制尚待研究，另外对于其用于放疗增敏的最大安全剂量、联合放疗的最佳配比剂量等，尚需通过动物实验进一步明确。

参考文献：

[1]潘新良.强化喉癌的规范化治疗不断提高喉癌治疗水平[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志，2014，49(6)： 617.

[2]Sunavala Dossabhoy G.Analysis of eIF4E and 4EBP1 mRNAs in head and neck cancer[J].Laryngoscope,2011,121(10):2136.

[3]Hayman TJ, Williams ES.Translation initiation factor eIF4E is a target for tumor cell radiosensitization[J].Cancer Res,2012,72(9):2362.

[4]蒋鑫.利巴韦林与eiF4E相关性急性髓系白血病的研究进展[J].国际输血及血液学杂志,2013,36(3):244.

[5]杜灵彬,毛伟敏.中国2003-2007年喉癌发病率和死亡率分析[J].中华流行病学杂志，2013(16):395.

[6]徐志渊.放疗后生存5年以上局部晚期喉癌的预后因素分析[J].国际肿瘤学杂志，2011,38(11):861.

[7]骆云珍等.喉癌放射抵抗及靶向放射增敏研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2014,49(6):520.

[8]YangH,In vivo study of breast carcinoma radiosensitization by targeting eIF4E[J].Biochem Biophys Res Commun，2012,423(4):878.

[9]马敏杰等.真核细胞翻译起始因子4E、血管内皮生长因子与食管癌血管生成及转移的关系[J].重庆医科大学学报，2010,35(11):1634.

[10]Borden KL, Culjkovic-Kraljacic B.Ribavirin as an anti-cancer therapy: acute myeloid leukemia and beyond[J].Leuk Lymphoma,2010,51(10):1805.

[11]董济民，肿瘤放疗增敏研究进展[J].陕西医学杂志2011,40(4):493.