槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制及诱导凋亡作用

槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制及诱导凋亡作用

史桂兰，黄琳，卿海燕，陈琦

(解放军208医院 肿瘤科， 吉林 长春130062)

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，多数肝癌发现时已为晚期，进展快，预后差[1]，从天然植物中寻找高效低毒的抗肝癌药物的一直是研究热点[2]。槲皮素(1，3，4，5，7-五羟基黄酮，Quercetin)是存在于多种植物的果实和花中的天然黄酮类物质，槲皮素具有抗炎、抗过敏、抗氧化、抗病毒、调节免疫、降血脂、抗氧化，抗癌等多种生物学活性，研究表明槲皮素体外可以抑制结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡[3-8]。本研究体外观察槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，为其进一步应用于临床治疗肝癌提供理论依据。

1料和方法

1.1　细胞培养

人肝癌SMMC-7721细胞由吉林大学基础医学院病理教研室馈赠，10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)高糖DMEM 培养基培养，添加青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2　药品和试剂

高糖DMEM培养基(美国Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)， 3-(4，5-二甲基噻唑-2)．2，5．二苯基四氮唑溴盐(MTT，美国Sigma公司)，Giemsa染色试剂盒购自北京鼎国生物技术公司，吖啶橙(AO)染色试剂盒购自南京凯基生物公司，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司。槲皮素购自美国Sigma公司，用前溶于二甲基亚砜(DMSO) 配制成1 mol/L溶液，加药前用含10% DMSO 的双蒸灭菌水配制成所需的实验浓度。

1.3　MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC-7721细胞生长的影响

参考文献96孔板每孔接种SMMC-7721细胞1×104个，[9]MTT法测定100、80、40、20、10、0 μmol/L槲皮素作用24、 48和72 h对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用，并计算IC50值。

1.4　Giemsa染色观察细胞形态

预先放置无菌盖玻片的6孔板每孔接种5×105个SMMC-7721细胞，培养过夜加入槲皮素，48 h后取出盖玻片，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两遍，4%对聚甲醛固定，按照说明书的方法染色，水洗，干燥，镜检。

1.5　AO染色检测细胞凋亡

收集槲皮素作用48 h的SMMC-7721细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，移液器吸取95 μl细胞悬液于5 ml离心管内，加入5 μl AO储存液混匀，AO终浓度为0.1 mg/ml，吸取10 μl 细胞悬液滴于显微载玻片上，盖玻片封片，避免封入气泡，荧光显微镜下观察细胞形态，摄片。

1.6　AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡

参照文献[10]方法，严格按照说明书操作，采用流式细胞仪测定槲皮素作用48 h的SMMC-7721细胞的凋亡率。

1.7　统计学分析

2结果

2.1　槲皮素对肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用

对照组SMMC-7721细胞生长活跃，SMMC-7721细胞在 10,20，40,60,80,100 μmol/L檞皮素作用24、48和72 h后，生长均不同程度减慢，抑制率逐渐升高，并呈明显的浓度和时间依赖性(表1)，槲皮素作用SMMC-7721细胞48 h的IC50为48.8 μmol/L。

2.2　肝癌SMMC-7721细胞的形态改变

对照组细胞形态规则，大小较一致，贴壁生长；槲皮素IC50组部分SMMC-7721细胞脱落悬浮于培养液中，贴壁细胞密度低，形态不规则，收缩变圆。

表1　槲皮素对人SMMC-7721细胞生长抑制作用

注：与同时间0 μmol/L组比较，a：P<0.05，b：P<0.01；c：24 h与72 h组间比较，P<0.05，d：24 h与48 h组间比较，P<0.05.

Giemsa染色可见对照组细胞完整，核仁明显，可见多核细胞;槲皮素IC50组细胞皱缩，细胞核固缩或核碎裂为数个小颗粒，表现为典型的凋亡细胞的形态学改变,见图1。

图1　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721细胞的Giemsa染色结果 (×200)

AO染色镜下观察，对照组SMMC-7721细胞表面为正常细胞的染色特征，细胞核呈均染绿色荧光；槲皮素IC50组部分细胞出现胞质浓缩，体积缩小，核固缩，表现为新月状、念珠状，见图2。

图2　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721细胞的AO染色结果 (×200)

2.3　槲皮素诱导SMMC-7721细胞凋亡

各组SMMC-7721细胞经Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果表明，槲皮素IC50组早期凋亡率为(49.8± 5.8)%，与阴性对照组(0.9±0.1)%比较差异有统计学意义(P<0.05)；晚期凋亡率为(14.3±1.8)% ，与阴性对照组(1.2±0.6)%比较差异有统计学意义(P<0.05)。研究结果表明槲皮素体外可诱导SMMC-7721细胞凋亡，见图3。

图3　48.8 μmol/L槲皮素作用48 h SMMC-7721细胞凋亡检测结果

3讨论

大量研究表明，肿瘤的发生发展与细胞凋亡有关[11]，目前临床应用的多种化疗药物主要是通过诱导其凋亡而发挥作用的，从天然植物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物是当前的研究热点之一。本研究首先采用MTT 法检测了槲皮素对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，结果发现槲皮素体外明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的生长，槲皮素对其增殖抑制作用随作用时间的延长和浓度的增加而增强，具有明显时间和剂量。

细胞凋亡是细胞的一种死亡方式，细胞凋亡与肿瘤的发生、发展密切相关[12,13]，通过诱导肿瘤细胞凋亡治疗癌症具有重要意义，许多抗癌药物通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗癌作用[14]。槲皮素体外是否诱导对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡？本研究采用Giemsa染色、AO 荧光染色和流式细胞术Annexin-V 和PI 双标染色，多种技术检测肝癌SMM-7721 细胞凋亡情况。

凋亡细胞具有典型的形态学特征，这些特征可以作为鉴定细胞是否凋亡的标准。凋亡细胞的典型形态特征为：细胞皱缩变圆、体积变小、胞质浓缩，染色质浓缩，核碎裂，形成凋亡小体等[15]。本研究发现槲皮素作用SMMC-7721细胞48 h后，胞膜皱缩、收缩变圆，Giemsa染色可见细胞核固缩，甚或核碎裂为数个小颗粒，表现为凋亡的形态学特征。AO荧光染色结果同Giemsa 染色结果一致，对照组细胞核为均匀绿色荧光，槲皮素组细胞出现胞质浓缩，荧光增强，表现为致密浓缩的绿色荧光，细胞核固缩，呈新月状或念珠状，研究结果从形态学上初步证实了槲皮素可诱导SMMC-7721 细胞凋亡。

同时本研究采用Annexin V-FITC/PI 双荧光染色流式细胞仪定量检测凋亡率，结果显示，随着槲皮素浓度的增加，SMMC-7721细胞早期和晚期凋亡率与对照组比较差异有统计学意义，表明槲皮素可能通过诱导SMMC-7721细胞凋亡抑制其生长。另外晚期凋亡率增加表明坏死也可能参槲皮素对SMMC-7721细胞生长的抑制作用,其具体机制还有待于进一步深入研究。

综上所述，本研究观察了槲皮素体外对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用，并从形态学方面观察到槲皮素可以诱导肝癌SMMC-7721出现典型的凋亡特征，流式细胞仪定量检测凋亡率结果与形态学观察结果一致，确证槲皮素对肝癌SMM-7721细胞的增殖抑制作用是通过诱导其凋亡实现的。

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收稿日期：(2014-01-22)

文章编号：1007-4287(2015)01-0017-03