重楼皂苷Ⅶ联合顺铂通过内质网应激诱导卵巢癌细胞凋亡

张嘉玲，郑长军，杨瑞琦，王　飞，范丽梅

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

重楼皂苷Ⅶ联合顺铂通过内质网应激诱导卵巢癌细胞凋亡

张嘉玲，郑长军，杨瑞琦，王飞，范丽梅*

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0006)

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率逐年上升，严重威胁着女性健康[1]。传统的手术治疗虽可以切除肿瘤病灶，但残存的癌细胞则可以引起肿瘤的复发与转移；而放化疗因其本身存在的严重毒副作用和耐药性，使其临床应用受到了很大限制[2，3]。近年来，随着分子生物学、中药化学等的发展，应用中药有效成分治疗来清除病灶成为肿瘤治疗领域的发展趋势。重楼(Paris polyphylla Smith var.Yunnannensis)为百合科重楼属植物的干燥根茎，极具药用价值；而重楼皂苷Ⅶ是重楼中的主要有效成分，其能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[4-6]。以铂类为基础的联合化疗是肿瘤的标准化疗方案，顺铂主要通过损伤肿瘤细胞的DNA结构产生抗癌作用，已在临床上广泛应用；因此，我们推测联合重楼皂苷Ⅶ与顺铂可有效的治疗卵巢癌。我们前期实验已证实重楼皂苷Ⅶ对A549细胞的增殖有明显抑制作用，说明重楼皂苷Ⅶ具有良好的抗肿瘤效应，其机制可能是通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的；但是，重楼皂苷Ⅶ是否能有效治疗卵巢癌还有待探索。本研究将联合重楼皂苷Ⅶ和顺铂处理卵巢癌细胞SKOV3，并探索其相关分子机制，为卵巢癌的治疗提供实验基础。

1材料与方法

1.1　重楼皂苷Ⅶ的制备

取干燥的重楼块根，粉碎，称100 g样品，加70%的乙醇800 ml回流提取3次，每次2 h，过滤，合井滤液，减压浓缩至浸膏。加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙醋萃取，除去亲脂性的成分，再用正丁醇萃取，正丁醇部分减压浓缩至浸膏，冷冻干燥为粉末状，反复用乙醇溶解-丙酮沉淀3次，最后将沉淀再次冷冻干燥，得浅棕色粉末，即为重楼皂苷。最后用高效液相分离得到重楼皂苷Ⅶ，成份经省药监局鉴定纯度达99.9%。

1.2　MTT法检测SKOV3细胞增殖

SKOV3细胞购自美国ATCC细胞库，在含 10%胎牛血清中的 IMDM培养液中，5%CO2，37℃细胞培养箱中培养。细胞传代3-5代后取对数生长期细胞，配制成浓度为1×105/ml的细胞悬液，以每孔200 μl的体积接种于 96孔板中。培养24 h后加入不同浓度的重楼皂苷Ⅶ和顺铂处理细胞：0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂、1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂、10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 顺铂，并设置空白对照组，每组设3个复孔。在上述条件下继续培养24 h和48 h后，每孔加入用无血清培养液配制的MTT 100 μl，使终浓度为0.5 mg/ml，继续培养4 h后，每孔加100 μl DMSO 终止反应，振荡混匀，用酶标仪测定其吸光度(A570)值。试验重复3次，取平均值。生长抑制率(%)=(对照组 OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100%。

1.3　Hoechst染色检测细胞凋亡

SKOV3细胞按1×105个/孔接种于24孔板中(孔板中事先铺上1 cm×1 cm的玻片)，置于37℃，5% CO2的恒温二氧化碳细胞培养箱中培养24 h。待细胞达到80%左右融合时，加入受试药物：0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂、1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂、10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂，继续培养24 h。弃掉培养液，PBS洗涤3遍，加入Hoechst 33258染料，置于37℃，5% CO2的恒温二氧化碳细胞培养箱避光染色10 min。PBS洗涤玻片3次，共聚焦显微镜下观察细胞核的染色情况。

1.4　Real-time PCR

对数生长期SKOV3细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA。Caspase3、XBP1、ATF4、GAPDH基因引物见表1。使用TAKARA公司的SYBR Green染料按说明书配制PCR反应液，置Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃，2 min预变性，然后按93℃，1 min，55℃，1 min，72℃，1 min，共做40个循环，最后72℃，10 min延伸。结果以GAPDH为内参，2-△△CT法计算各基因相对表达量。

表1　Real time-PCR各基因引物序列

1.5　统计学分析

2结果

2.1　细胞增殖率

SKOV3细胞用不同浓度重楼皂苷Ⅶ和顺铂处理24h和48h后，MTT法检测细胞增殖受到不同程度的影响。0.1μg/ml重楼皂苷Ⅶ和1μg/ml顺铂组对细胞增殖有轻微影响，而1μg/ml重楼皂苷Ⅶ 和1μg/ml顺铂组，以及10μg/ml重楼皂苷Ⅶ组对细胞增殖影响较大，与对照组相比有统计学差异(P<0.05，图1)。

图1MTT检测重楼皂苷Ⅶ联合顺铂处理SKOV3细胞增殖率，随重楼皂苷Ⅶ浓度增加，细胞增殖率降低，且48h较24h增殖率低。*P<0.05。

2.2　细胞凋亡率

为检测SKOV3细胞增殖抑制是否是由凋亡引起，在同样的药物处理48 h后，我们用Hoechst染色检测了细胞的凋亡率。实验结果发现0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ和1 μg/ml 顺铂组中蓝色的凋亡细胞较对照组多，但两组间无统计学差异(P>0.05)，但1 μg/ml和10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ组中调亡细胞较多，相比对照组而言有明显的统计学差异(P<0.05)，且存在剂量依赖性(图2)。说明经重楼皂苷Ⅶ和顺铂处理后，卵巢癌细胞会经凋亡死亡。

2.3　Caspase3、XBP1和ATF4基因表达变化

为分析SKOV3细胞凋亡的分子机制，我们检测了凋亡相关基因caspase3，内质网应激相关基因XBP1和ATF4的表达变化。实验结果发现药物处理会使caspase3基因表达上调，进而促进肿瘤细胞凋亡。同时，XBP1和ATF4基因的表达也上升了(图3)，证明细胞凋亡是由内质网应激引起的。我们的实验为治疗卵巢癌提供了靶位点，即可从缓解内质网应激入手。

图2Hoechst染色检测重楼皂苷Ⅶ联合顺铂处理SKOV3细胞凋亡率，随重楼皂苷Ⅶ浓度增加，细胞凋亡率增加。A：0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 顺铂；B：1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ + 1 μg/ml 顺铂；C：10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ +1 μg/ml 顺铂。*P<0.05。

图3Real-time PCR检测Caspase3、XBP1、ATF4基因的相对表达量。A：0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂；B：1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂；C：10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml 顺铂。*P<0.05。

3讨论

在我们的前期研究中，已发现重楼皂苷能有效抑制肿瘤的生长；因此，在此研究的基础上，我们提取重楼皂苷中的有效成份，加上有效的化疗药物顺铂处理SKOV3卵巢癌细胞，结果发现这两种药物经过适当的配比，能有效地促进肿瘤细胞凋亡，并且其机制是通过内质网应激引起的，为治疗卵巢癌提供了新的思路。目前，临床上应用铂类和紫杉醇的联合化疗已经明显改善了卵巢癌的治疗效果，尤其近期治疗效果，大大提高了患者5年生存率[7]。铂类是卵巢癌首选的一线化疗药物，其为一种抗癌谱较广的细胞周期非特异性抗肿瘤药物；但化疗病人还是至少有80%的情况最终会出现耐药性，最终导致肿瘤治疗失败，肿瘤复发、转移、扩散，这是制约卵巢癌治愈率提高的非常关键的因素，尽管目前二线、三线化疗药物的应用已经取得了一些近期疗效，但由于产生的继发耐药而使远期疗效并不能令人满意。因而，提高化疗药物的疗效，降低耐药性，对改善患者预后尤为重要，因而逆转化疗耐药的研究为所有问题的重中之重，具有重要的理论和实际意义[8]。中药因其具有良好的生物安全性和广泛的药理作用，能够针对肿瘤耐药的多因素、多水平发挥作用。研究显示，中药调节机体的免疫系统提高免疫力，发挥对机体的保护作用[9]。中药通过增加Caspase-3基因表达、降低Bcl-2、Survivin基因的表达，使肿瘤细胞的耐药性下降，诱导细胞凋亡。有研究报道，筛选出多种中药逆转剂，能够明显增强多药耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、降低耐药。研究也显示其逆转作用呈剂量、时间依赖关系[10,11]。这些研究结果均和我们的结果一致，我们的实验结果也显示中药重楼皂苷联合顺铂后可增加Caspase3基因的表达，诱导细胞凋亡。XBP-1和ATF4均是内质网应激反应下游重要的信号因子，其表达增加可间接证明内质网应激反应的发生，本研究从此方面间接证明了重楼皂苷诱导的SKOV3细胞的凋亡是由内质网应激引起的。

参考文献：

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[3]Meyn RE,Stephens LC,Hunter NR,et al.Kinetics of cisplatin-induced apoptosis in murine mammary and ovarian adenocarcinomas [J].Int J Cancer,1995,60(5):725.

[4]Ma DD,Lu HX,Xu LS,et al.Polyphyllin D exerts potent anti-tumour effects on Lewis cancer cells under hypoxic conditions[J].J Int Med Res,2009，37(3):631.

[5]武珊珊，高文远，段宏泉，等.重楼化学成分和药理作用研究进展[J].时中草药,2004,35(3):344.

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[8]冯国梁，高励聪，李秀萍．抗癌中药的研究进展[J].疾病监测与控制，2010,4(1)：7.

[9]黄自丽，黄修燕，郑起．中药抗肿瘤作用及其作用机制研究进展[J].医学综述，2010,16(3)：386.

[10]Hiroshima Y,Bando M,Kataoka M，et al．Shosaikoto increases calprotectin expression inhuman oral epithelial cells[J].Journal of Periodontal Research，2010,45(1)：79.

[11]Zhang J，Shen YL，Liu JW，et al．Antimetastatic effect of prodigiosin through inhibition of tumor invasion[J].Biochemical Pharmacology，2005,69(3)：407.

摘要：目的探讨重楼皂苷Ⅶ联合顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的分子机制。方法从中草药重楼块根中分离提取重楼皂苷Ⅶ，然后联合顺铂处理SKOV3细胞，分为以下4组：0.1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml顺铂组、1 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml顺铂组、10 μg/ml重楼皂苷Ⅶ+1 μg/ml顺铂组、对照组。培养24 h和48 h后，MTT法检测细胞增殖率，Hoechst染色检测细胞凋亡率，Real-time PCR检测凋亡相关基因caspase3以及内质网应激相关基因XBP1和ATF4的表达。结果重楼皂苷Ⅶ联合顺铂能有效促进SKOV3细胞凋亡，其凋亡是通过内质网应激激活caspase途径引起的。结论重楼皂苷Ⅶ能有效抑制肿瘤细胞生长，为临床上治疗卵巢癌提供了实验依据。

关键词：卵巢癌；重楼皂苷Ⅶ；顺铂；凋亡；内质网应激

Apoptosis of ovarian cancer cells induced by polyphyllin VII and cisplatin through endoplasmic reticulum stressZHANGJia-ling,ZHENGChang-jun,YANRui-qi,etal.(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of apoptosis of SKOV3 cells induced by polyphyllin VII and cisplatin.MethodsThe polyphyllin VII was extracted from polyphylla root,then used to treat SKOV3 cells combined with cisplatin.The experiments were divided into four groups:0.1 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group,1 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group,10 μg/ml polyphyllin VII+1 μg/ml cisplatin group and control group.24 h and 48 h later,the cell proliferation was detected by MTT,cell apoptosis rate was determined by Hoechst staining,and the apoptosis-related gene caspase3 and endoplasmic reticulum stress-related gene XBP1 and ATF4 were detected by real-time PCR.ResultsCombination of polyphyllin VII and cisplatin could be effective in promoting the apoptosis of SKOV3,which was activated through endoplasmic reticulum stress.ConclusionPolyphyllin VII could effectively inhibit the proliferation of tumor cells,which provided an experimental basis for treatment of ovarian cancer in clinic.

Key words:ovarian cancer;polyphyllin VII;cisplatin;apoptosis;endoplasmic reticulum stress

收稿日期：(2014-05-20)

文献标识码：A

中图分类号：R737.31

文章编号：1007-4287(2015)01-0006-04

通讯作者*

基金项目：中国博士后基金资助(2013M541316)；吉林省卫生厅科研课题(2013Z097);吉林省产业技术研究与开发项目(2013C026-4)