β>3肾上腺素能受体基因多态性与冠心病发病相关性的研究



β>3肾上腺素能受体基因多态性与冠心病发病相关性的研究

刘永生1,韩洪波2,赵佳辉1

(1.解放军第208医院 心内科，吉林 长春130062；2.解放军第208医院 内分泌科)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是由于冠状动脉器质性和/或功能性病变引发的冠状动脉供血与心肌耗氧量间的供需矛盾而导致的心肌缺氧损害。本病系病死率极高的疾病之一，已被公认为是人类健康的杀手。可见如何对冠心病做到早诊断、早治疗、早预防是我们目前需要攻克的医学难关。但目前冠心病的病因并未被完全阐明，其病因复杂，是先天遗传物质基础与后天饮食、代谢、运动等生活习惯因素长期相互做用而引发的这一观点已得到公认。在后天生活习惯等因素在防治冠心病被强调的同时，人们同样渴望在基因水平探讨出冠心病的发病相关因素。一些与脂代谢密切相关的基因已经成为本病的候选基因而被作为针对本病病因的研究热点。肾上腺素能受体在冠心病的病因研究中一直占较重位置，继β1-AR与心肌耗氧量及β2-AR与血管损伤被广泛研究后，β3-AR已被重视并深入研究，曾有研究表明β3-AR可以介导脂肪代谢相关反应，使之分解生热[1]，也有学者称此受体基因变异能够导致脂代谢异常及肥胖，而如上两条均为冠心病发病的高危因素，鉴于此，β3-AR基因进入了冠心病发病的重要候选基因群。对于β3-AR基因的多态性研究较多的是此基因第一外显子的第190位点多态性，此基因位点野生型的T可以突变为C，本实验针对这一位点的多态性进行了一系列研究，从所得数据分析此位点多态性与冠心病的发病及病情轻重的相关性，报道如下。

1材料与方法

1.1研究对象冠心病组：选自于解放军208医院就诊的患者，就诊时段为2009年2月-2014年5月，入选患者均经冠状动脉造影确诊的冠心病患者131人，其中男性69人，女性62人，年龄为50.12±6.95。健康中老年人组系同期于解放军208医院门诊体检或住院的中老年人，经320排CT或冠状动脉造影检查排除冠心病，经随机选取所得实验对象共计125人，其中男性66人，女性59人，年龄为52.13±7.54。以上两组实验对象年龄及性别比例均经统计学检验显示组间呈现匹配关系。冠心病患者131人按冠状动脉造影结果行SYNTAX评分[2]分为3组，分组相关详细数据见表1。

表1　冠心病组按SYNTAX评分分组情况

以上3组实验对象的性别比例、年龄经统计学检验显示各组间呈现匹配关系。所有实验对象血常规、肝功能及肾功能均正常，需排除肝、肾疾病。糖尿病患者为本实验排除对象。所有实验对象均为汉族，且各实验对象间无血缘关系。

1．2制备模板DNA 实验对象均晨起时采集空腹静脉血4 ml，抗凝剂用EDTA-K2，参照文献中所讲的碘化钠裂解、戊醇及氯仿提取法[3]经白细胞提取基因组DNA，所提取DNA-30℃保存。

1．3引物合成引物设计均参照文献[4]，针对β3-AR基因第一外显子的一个片段，此片段中包含第190位点及其上下游的相关DNA序列。(两引物均由上海生工生物工程有限公司合成)上游引物为：5′-CGCCCAATACCGCCAACA-3′下游引物为：5′-CCACCAGGA GTCCCATCACC-3′。

1．4扩增条件及反应体系本实验PCR体系25 μl ，体系含DNA模板100 ng，2.5 μl 10×PCR缓冲液，Taq酶2.5 U (上海生工生物工程有限公司生产)，15 mmol/L dNTPs 0.5 μl ，引物上、下游各2 μl。反应条件：预变性96℃5 min，此后95℃、55℃、72℃各40 S，循环30次，延伸温度72℃，时间10 min，保存温度为4℃。所用PCR仪为Primus25型。

1．5限制性酶切条件取5 μl前述实验所得PCR扩增产物，在37℃下用BstNI 10U酶切作用7 h。反应完成后，如上酶切产物在120 V 电压下于3%琼脂糖凝胶电泳6 h，电泳后EB染色，此后以长度DL100DNA为标准进行参照分析，结果需在紫外灯下判断，拍照留存。

1．6统计学方法采用组间直接对比分析法，计算各基因型及等位基因频率在人群中所占百分比，不同组间等位基因频率对比用χ2检验，所用软件包为SPSS13.0。组间具有显著性差异的标准为P<0.05。

2结果

2．1β3-AR基因第一外显子190位点分析PCR扩增产物大小为210 bp，此扩增产物包含待测位点及其上下游的一段DNA序列，此位点T/C突变发生后可使原有的一个BstNI限制性酶切位点消失，据此以BstNI酶切扩增产物后分析。基因型共有3种：正常纯合子TT型可得酶切产物为5条带(99、62、30、12、7 bp)，突变杂合子TC型为6条带(161、99、62、30、12、7 bp)，突变纯合子CC为4条带(161、30、12、7 bp)，本基因型的判断主要通过读取99及161 bp两个条带来完成。

2．2冠心病组及对照组两组人群待测位点T/C多态性比较分析此位点多态性分布在如上两组人群中的分布频率有显著性差异(P<0.05)，详见表2。

表2　冠心病组与对照组β3-AR基因第一外显子190位点T/C频率分布〔n(%)〕

冠心病组与健康中老年组对比显示组间基因型分布存在明显差异P<0.05

2．3SYNTAX评分各组人群待测位点T/C多态性比较分析冠心病3个亚组间此位点多态性分布无显著性差异(P>0.05)，详见表3。

表3　SYNTAX评分各组β3-AR基因第一外显子190位点T/C频率分布〔n(%)〕

如上三组间待测位点多态性分布频率差异无显著性P>0.05

3讨论

冠心病近年来发病呈现明显上长趋势。2008年世界卫生组织统计数字显示心血管病患者约占全年总死亡人数的1/4。目前以细菌培养加药敏为指导的抗生素正规使用及以多维超声在产前检查中应用的日益广泛，就病因将心血管疾病分类的组成比例也随之明显改变，也就是原来在心血管病组成中占主要比例的风湿性心脏病和先天性心脏病的比例明显减低，而冠心病随着全社会的人口老龄化在心血管病中的比率大为提高。在我国有统计数字显示冠心病在男性发病率比过去增加26.10%，在女性为19.00%。对中老年人群而言，冠心病是一种常见而后果严重的疾病，从基因角度将其病因进一步阐明一直是众多心血管科医务工作者的渴望。许多医务工作者坚定的认为冠心病是一种与多基因相关的疾病，如果这一疾病的基因水平发病相关因素得以一一阐明，那么对这一疾病的防、诊、治能力将随之有极大的提高。

β3-AR是众多跨膜受体中的一种，是G蛋白偶联受体，这种受体在人类的棕色及白色脂肪中均有分布。除此之外，心脏、消化道、骨骼肌等部位也有这种受体分布，但含量相对脂肪组织较少。β3-AR具有促进白色脂肪分解及棕色脂肪产热的作用，是人体基础代谢率和脂肪代谢的重要调节因子。已有临床研究证明冠心病患者的血胆固醇、低密度脂蛋及甘油三酯水平均明显高于无冠心病者。血脂异常者更易发生动脉粥样硬化，且血脂异常的严重程度与血管病变的程度及弥漫程度正向相关[5]。有血脂异常的冠心病患者经正规的他汀类药物治疗，其冠心病程度的进展会得到一定程度的控制[6]。鉴于如上分析，β3-AR基因就成了研究冠心病发病相关因素的重要候选基因之一，针对这一基因各多态性位点的研究将会对冠心病基因水平的发病相关因素的阐明有所帮助。

人β3-AR的一级结构由402个氨基酸组成，分子量为42281，其四级结构中含20余处疏水区，最终可以构成细胞内外各4处功能区。该基因由2个外显子和1个内含子组成，位于8号染色体。β3-AR基因编码区在第一外显子第190位点存在T/C多态性，这个位点核苷酸由胸腺嘧啶核苷酸到胞嘧啶核苷酸的转变会引发β3-AR一级结构第64位氨基酸密码子的改变，即由色氨酸密码子(TGG)改变为精氨酸密码子(CGG)，这一突变会引起β3-AR的翻译结果，改变蛋白质一级结构。而这个因基因突变而变化的氨基酸是位于β3-AR的第1个细胞内环上，第一个细胞内环是β3-AR 完成偶联和发挥效应器功能至关重要的部位[7]。这一氨基酸改变可导致β3-AR活性下降，也就是说这一位点变异可以阻碍与脂代谢相关的细胞信号传导，从而降低棕色脂肪和白色脂肪的脂解和产热效应，并降低基础代谢率，从而导致血脂异常而成为冠心病的高危因素。

要着手研究某候选基因与冠心病严重程度的相关性就必须对冠心病的轻重分度有一个相对客观的方法。众所周知冠心病临床表现是多种多样的，症状轻重不一，但冠状动脉粥样硬化的病理表现是绝大多数患者共同具有的。冠状动脉造影一直是冠心病诊断的金指标，即使如此，冠脉病变的部位及程度使本病的分度相当复杂，而SYNTAX研究总结出了一套评分方案[8]，可以用于评价冠状动脉病变的程度，且这一评分方式综合考虑了如上所述的冠脉造影结果的各种复杂因素，是较为客观的分度方式，此评分越高说明冠脉病变程度越重，同时也意味着预后可能越差[9]。鉴于此，本实验依据此评分结果将冠心病组患者分度，所得结果是有一定可信度的。

事实上冠心病发生不仅与遗传因素有一定的相关性，还与许多外界因素比如多种环境因素有关，β3-AR基因如上位点与冠心病的发病具有一定程度相关性而与SYNTAX评分所示的冠心病轻重程度无关，这其中有两种可能性：其一，冠心病作为一种具有一定程度遗传倾向的疾病，其发病也必然是与多种基因变异相关的，β3-AR基因第一外显子的第190位点的多态性可能是与冠心病发病相关而与其发病程度不具相关性的位点；其二，在冠心病发生及不断加重的进程中，可能有些许基因水平的因素与之相关，但诸多后天因素如环境因素、生活习惯等也一定是冠心病发生、进展的重要因素[10]，而这些因素在冠心病加重的进程中可能所起的作用更大。

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[6]陈瑞雪，张丽华，李小威．郑州市区冠心病患者他汀类药物应用现状分析 [J]．中国心血管杂志,2014，19(1)：42.

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[9]Garg S,Sarno G,Garcia-Garcia HM,et al.A new tool for the risk stratification of patient with complex coronary artery disease:the clinical SYNTAX score[J]．Circ Cardiovasc Interv,2010,3(4):317.

[10]杨淑珍，孙宇．血清胱抑素C和尿酸水平对冠心病病变程度的预测价值[J]．中国实验诊断学,2014，18(2)：265.

(收稿日期：2014-07-26)

文章编号：1007-4287(2015)07-1157-03