1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮抗癫疒间药理活性研究

熊 琳，朱 军，李 鹏，陈琴华*

·药学研究·

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮抗癫疒间药理活性研究

熊 琳1,2，朱 军1,2，李 鹏1,2，陈琴华1,2*

目的 从合成的大量化合物中筛选抗惊厥活性比较好的化合物，为新型抗癫疒间药物的开发提供依据。方法 以乙内酰脲类化合物为母核，对其化学结构进行改造优化，合成1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)。采用最大电休克惊厥实验(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)实验、最大电休克惊厥阈值实验、戊四氮(ipPTZ)阈值实验评价MVPM化合物的抗惊厥活性。结果 MVPM化合物抗MES、PTZ的ED50分别为14.7、41.7 mg/kg。MVPM化合物可提高小鼠最大电惊厥发作阈值，提高小鼠惊厥的耐受性，并且呈现剂量依赖性。结论 该化合物抗癫疒间活性好，具有进一步研究开发的价值。

1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮；抗癫疒间；药理活性；MES；PTZ

0 引言

癫疒间是神经混乱疾病中比较常见的一种，在世界范围内，约有5 000多万例患者，发病率与很多疾病相比较高(约0.5%～1.0%)，死亡率约为1.0%～3.0%。虽然目前已经有许多治疗效果较好的抗癫疒间药物，仍然有大部分癫疒间患者的病情不能得到有效的控制。

乙内酰脲类衍生物具有多种药理活性，如抗惊厥作用、抑制血小板凝聚、抗心律失常、抗病毒、拮抗细胞黏连等。本课题组一直致力于乙内酰脲衍生物的合成和药理活性的研究，从已经合成的大量化合物中筛选出抗惊厥活性比较好的化合物[1-2]，本试验就化合物1,1,6-三甲基-4,6-二氮螺[2.4]庚烷-5,7-二酮(MPVM)作为抗癫疒间药物的研究与开发价值进行初步成药性研究，得到该化合物的初步评价。

目前，在抗癫疒间药物筛选过程中，通常采用三种模型，包括最大电惊厥(MES)、戊四氮诱导的发作模型(PTZ)以及点燃模型(Kindling model)。这些模型可以在小鼠、大鼠、狗、猴子等动物体内建立。在这些筛选模型中，研究新的抗癫疒间药物普遍采用的是MES和皮下注射PTZ(scPTZ)发作模型[3-5]。MES和scPTZ模型用于筛选抗惊厥药物的优点较多。首先，这两种模型容易操作，可以大量筛选，需要的设备投资最小，技术含量要求不高；此外，通过这两种方法获得的数据比较有价值，能够作为抗惊厥化合物的评判依据。在目前上市的抗癫疒间药物中，除了乙拉西坦(LEV)[6-7]，其他药物在这两种模型至少有一种是具有活性的。

1 合成试验

1.1 仪器与试药 RE-5298型旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂)，GF-254硅胶(青岛海洋化工厂)，XT-4型显微熔点测定仪(上海济成分析仪器有限公司)，其他试剂均为国药化学纯(CP)或分析纯(AR)。

1.2 方法 合成路线：见图1。具体合成方法参考文献[2]。

图1 合成路线图

2 药理试验

2.1 材料 YSD-4G型药理生理实验多用仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)。电子天平，小鼠鼠笼、灌胃针头、注射针头，1 mL注射器若干。SPF级昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由武汉大学动物实验中心提供。实验前1周饲养于鼠笼中，自由进食和纯净水。饲养条件为自由光照，温度(23±3)℃，相对湿度55%±5%。1周的试验条件饲养之后，小鼠根据试验所需只数随机分组，每只小鼠只用1次且所有的试验在8∶00～16∶00进行。

2.2 方法 抗癫疒间药理试验采用美国国立卫生院公布的抗癫疒间药物开发程序[8-9]先进行Ⅰ期药理试验，结果表明，该化合物具有较好的药理活性[10]，具有开发价值，可以进行下一步试验，为临床试验提供更为具体可靠的信息。本试验采用4种药理模型，最大电休克惊厥实验(MES)、皮下注射戊四氮(PTZ)实验、最大电休克惊厥阈值实验、戊四氮(ipPTZ)阈值实验评价MVPM化合物的抗惊厥活性。

2.2.1 最大电休克惊厥实验(MES) 在实验的前1 d使用YSD-4GA药理生理实验多用仪对饲养1周的小鼠进行筛选，筛选条件：50 mA，60 Hz，0.2 s。先将小鼠的两耳涂上一定量的注射用生理盐水，以保证鼠耳有良好的导电性能。用耳缘电极夹住小鼠两侧耳尖部即可通电，给予电刺激筛选出出现后肢强直的合格小鼠，即可用于下一步的活性测定实验。

实验步骤：取实验前1 d筛选合格的昆明小鼠，随机分成5组，每组10只，雄雌各半。按照预试验结果，设计梯度浓度，分别给予不同剂量的化合物，每组均采用腹腔注射给药。给药1 h后使用YSD-4GA药理生理实验多用仪在相同条件下给予小鼠电刺激，观察记录小鼠电刺激之后的实验行为。MPVM在该剂量下是否具有抗惊厥活性取决于小鼠的行为，若小鼠出现后肢强直则此剂量下无效，反之则有效。见表1。

表1 MPVM对抗小鼠MES惊厥ED50实验结果(n=10)

注：MESa，最大电惊厥

2.2.2 皮下注射戊四氮(PTZ)实验 实验小鼠(雌雄各半)随机分为空白组、受试MPVM组，每组10只。空白组注射等量溶媒，受试MPVM组腹腔注射化合物，1 h后，每组小鼠皮下注射85 mg/kg戊四氮。每组小鼠按照雌雄分别放于2个鼠笼中观察0.5 h。分别记录每组小鼠的行为情况，包括阵挛、强直和死亡的个数。

表2 MPVM对抗小鼠PTZ诱导惊厥ED50实验结果(n=10)

2.2.3 最大电休克惊厥阈值实验 为了评估最大电惊厥阈值，将小鼠随机分为4组，每组10只，用不同强度的电刺激，筛选10%～30%、30%～50%、50%～70%和70%～90%的发作小鼠。根据这些数据，计算出半数电流强度(CS50/mA)。

实验步骤：①空白对照：取40只SPF级昆明小鼠，随机分为4组，每组10只。每只小鼠用药前自身作为空白对照，小鼠腹腔注射一定量的溶媒，1 h后给予电刺激，根据小鼠的反应改变电流强度，记录小鼠惊厥发作阈值(CS50，mA)。②给MPVM后发作阈值实验：小鼠电惊厥后，至少隔48 h后才能进行第2次电惊厥实验。小鼠腹腔注射受试MPVM不同剂量。1 h后给予电刺激，观察并记录小鼠出现惊厥的电流强度，记录给药后小鼠发作阈值(CS50)，实验结果见图2。

图2 不同浓度MPVM对MES阈值改变(n=10)

2.2.4 戊四氮(ipPTZ)阈值实验 为了评价药物抗惊厥的活性，采用腹腔注射PTZ判断化合物对于提高机体对惊厥耐受性的指标。该模型能够评价一个药物调整发作阈值的效果。首先给小鼠一定剂量的化合物，然后腹腔注射不同剂量的PTZ，观察小鼠的发作阈值。

实验步骤：实验小鼠随机分为空白组、受试化合物MPVM组、对照品卡马西平组，每组按照表3中PTZ剂量分组，每组8只。空白组小鼠腹腔注射溶媒，受试MPVM组腹腔注射MPVM剂量为50 mg/kg，卡马西平组腹腔注射卡马西平剂量为100 mg/kg。1 h后开始腹腔注射PTZ，之后，小鼠可以在鼠笼自由活动以免影响观察阈值。观察30 min并记录小鼠的行为，以出现全身阵挛为观察指标。

表3 MPVM PTZ诱导癫疒间阈值发作实验结果(n=8)

3 讨论

MES试验中，MPVM的ED50为14.7 mg/kg，其半数有效量小于临床上常用的苯妥英，活性与苯巴比妥相当，强于丙戊酸钠。PTZ试验中，MPVM在PTZ诱导惊厥试验模型中的ED50为41.7 mg/kg；在PTZ诱导的癫疒间模型中，能够显著提高小鼠的癫疒间阈值，延长小鼠癫疒间发作潜伏期，虽然其对小鼠癫疒间发作死亡保护不及卡马西平，但其有效剂量远远低于卡马西平。MES阈值试验中，MPVM能够提高小鼠最大电惊厥发作阈值，并且呈现剂量依赖性。MPVM在腹腔注射25 mg/kg 1 h后，能够显著提高小鼠的电惊厥阈值：由6.7 mA提高到9.5 mA。PTZ阈值试验中，MPVM能够影响PTZ诱导的小鼠惊厥，与卡马西平相比，能够显著提高小鼠惊厥的耐受性，使得在此模型中小鼠CD50为75.3 mg/kg，而卡马西平为66.9 mg/kg。

抗癫疒间的动物模型种类较多，如：①局部运用γ-氨基丁酸受体拮抗剂(青霉素、木防己苦毒素等)；②点燃致惊模型；③化学点燃模型(海人酸、戊四氮等)；④MES和scPTZ模型。由于本实验室条件有限、一些药物是管制品难以购买及实验技术限制，使得MPVM作为抗癫疒间药物的药理活性评估所用模型较少。未来应进行更大规模、更多药理模型的试验。

Antiepileptic pharmacological activity of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro[2.4] heptan-5,7-dione

XIONG Lin1,2,ZHU Jun1,2,LI Peng1,2,CHEN Qin-hua1,2*

(1.Department of Pharmacy,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China;2.Institute of Pharmaceutical Analysis and Drug Screening,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

Objective To survey the pharmacological action of 1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione.Methods The chemical structure of hydantoin was modified to obtain analogs-1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione(MPVM) and examine the anticonvulsant activities of MPVM by MES test,PTZ test,electroconvulsive threshold test,PTZ-evoked seizure test.Results MVPM antagonized MES(ED50=14.7 mg/kg)and PTZ(ED50=41.7 mg/kg).MVPM could also raise mice′s electroconvulsive threshold and PTZ-evoked seizure threshold.Conclusion The compound has a good antiepileptic activity,it deserves for a further research with good development.

1,1,6-trimethyl-4,6-diaza-spiro [2.4] heptan-5,7-dione;Atiepileptic;Parmacological activity;MES;PTZ

2014-12-18

1.湖北医药学院附属东风医院药学部，湖北 十堰 442008；2.湖北医药学院药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008

湖北省卫生厅青年科技人才项目(QJX2012-45)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507015

*通信作者