ROS介导的JNK信号通路及其对细胞自噬的调节

唐锦华综述，吴 江，连继勤审校

（1.第三军医大学学员旅五营，重庆400038；2.第三军医大学生物化学与分子生物学教研室，重庆400038）

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是生物有氧代谢过程中产生的一类活性含氧化合物的总称，作为细胞内的一种信号分子，ROS可通过多种途径激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）。调节细胞自噬是ROS介导的JNK 信号通路的一个重要功能，其能够以ROS水平依赖的方式激活细胞自噬和凋亡。下面本文仅就近年来研究发现的ROS介导JNK 信号通路激活的主要途径，以及其对细胞自噬的作用作简要综述。

1 ROS与JNK 信号通路

ROS是一类可以氧化蛋白质、脂质和DNA 的小分子，是生物有氧代谢过程中产生的一类活性含氧化合物的总称，包括超氧阴离子（·O2-）、过氧化氢（H2O2）和自由基（超氧化物、羟自由基）等。正常生理状态下，ROS的产生被严格控制，且ROS作为一种信号分子参与调节了细胞内多种信号通路，而JNK 信号通路就是受ROS调控的一条重要通路［1］。

JNK 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中的一员，能有效地磷酸化c-Jun的氨基末端并激活c-Jun，是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。由于JNK 信号通路可被环境中的应激因素（如电离辐射、渗透压改变、营养因素撤除、热休克及活性氧等）激活，因此JNK 又被称为应激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）［2］。在细胞活动过程中，ROS可通过多种途径激活JNK 在细胞内发挥重要的生理功能。

2 ROS通过多种途径激活JNK

2.1 凋亡信号调节激酶1（ASK1）途径 ASK1在ROS介导的JNK 通路活化过程中起桥梁作用。在MAPK 信号传递过程中，ASK1是一个通过磷酸化MKK4 和MKK7、进而激活JNK 通路的上游MAPKKK，可被ROS等多种信号所激活［3］。在ROS的作用下，硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）分子上第32位与第35位的半胱氨酸残基被氧化形成二硫键，从而失去对ASK1的抑制作用。游离的ASK1之间可通过N 端和C 端的卷曲螺旋域形成寡聚体，并进一步被磷酸化而激活，最终导致JNK 激活［4］。Trx是一种结合在ASK1蛋白N 端卷曲螺旋域的负性调节因子。有研究提示在ASK1的C 端卷曲螺旋域也存在一个负性调节因子谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx），Grx可与氧化型谷胱甘肽（GSSG）反应形成复合物（Grx-SSG 及Grx［S-S］），促使Grx与ASK1解离［5］。在Trx和Grx从ASK1解离下来之后，作为ASK1正性调节因子的肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）和TRAF6可以结合到ASK1上，组成了一个活化的大分子复合体，即活化的ASK1信号小体，进而激活JNK。研究表明，Trx可以抑制ASK1信号小体的形成，而TRAF2的过表达则可以抑制Trx与ASK1的相互作用，使ASK1活化并激活JNK［6］。

2.2 Src激酶途径 Src家族激酶（Src-family kinases，SFKs）目前由LYN、FYN、LCK、HCK、FGR、BLK、YRK、YES和Src等9个成员组成，其中，Src蛋白是目前研究最多的成员。Src广泛存在于组织细胞中，通过与信号转导通路中重要分子相互作用，调控细胞的生长、发育、分化和死亡等过程。在ROS介导的JNK 信号通路中，Src的缺失将严重抑制JNK 的活化，Src途径是ROS激活JNK 的信号通路之一。Chen等［7］发现内皮细胞暴露H2O2后15min内可观察到的JNK 通路快速激活，认为H2O2可诱导表皮因子受体磷酸化，通过Src依赖性的途径启动JNK 的信号通路。在肿瘤的发生和转移过程中，高活性的Src可使Bruton蛋白激酶Btk29A 肽链上的551位酪氨酸去磷酸化而活化，同时活化连接蛋白p120ctn，后两者可通过小G 蛋白Rho1激活JNK［8-9］。

2.3 谷胱甘肽s-转移酶π（GSTπ）途径 GSTπ也是ROS介导JNK 活化的另一重要中间分子。最新的研究发现，两种单体形式的GSTπ可以通过与JNK 底物活化转录因子2（activating transcription factor 2，ATF2）的直接作用来抑制ATF2的磷酸化，进而抑制JNK1或JNK2的激活［10］。H2O2可使原来与JNK 羧基末端结合的GSTπ寡聚化并从GSTπ-JNK 复合体上分离下来，从而恢复被抑制的JNK 活性［11］。

2.4 混合谱系激酶3（MLK3）途径 MLK3是MAPKKK 家族MLKs亚家族的成员之一，也是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。它通过磷酸化激活MAPK 通路的丝／苏氨酸蛋白激酶，介导下游信号通路激活，是连接ROS和JNK 的重要纽带。Zhao等［12］的研究发现，混合谱系结构域样激酶（MLKL）是RIP3诱导细胞坏死样凋亡的重要下游分子，MLKL 的缺失会严重影响JNK 的磷酸化，进而降低ROS 对JNK 的激活作用。van den Berg等［13］发现，氧化应激引起的ROS水平增加可通过c-Jun氨基末端相互作用蛋白1（JIP1）支架复合体激活小G 蛋白RALA，进而调控JNK 的磷酸化，而MLK3 则是直接激活MKK4并与MKK4组成JIP1支架复合体的重要分子。

2.5 受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）-TRAF2复合体途径 RIP-TRAF2 复合体途径是ROS 激活JNK 的又一重要途径。RIP与TRAF2是TNF与TNF受体1（TNF-R1）结合后，激活核转录因子NF-κB、触发信号传导级联导致细胞凋亡的重要信号分子。近年来的研究表明，RIP 和TRAF2可以相互结合在靶细胞膜上的脂筏区，形成一个RIPTRAF2信号复合体，在ROS的诱导下直接激活JNK 通路［14］。

2.6 抑制丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶（MAPK phosphatases，MKPs）途径 MKPs的活性是ROS激活JNK 的另一有效途径。Kamata等［15］的研究表明，细胞内H2O2可以通过氧化MKPs的半胱氨酸残基而抑制MKPs的活性，被氧化的MKPs很快被泛素-蛋白酶体途径降解，从而消除了MKPs对JNK 的抑制作用，导致JNK 通路持续激活。Hou等［16］进一步证实，ROS介导的MKP 失活就是导致JNK 通路持续激活的原因。Lornejad-Schfer等［17］在ARPE-19 细胞中通过光诱导的方法也发现随着ROS产生的增加，MKP-1的水平会显著下降并导致JNK 激活。

3 ROS-JNK 通路对细胞自噬的调节作用

细胞自噬是细胞依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的过程，是细胞清除受损蛋白与细胞器的重要途径，通常在饥饿、氧化损伤、内质网应激等条件下水平增强［18］。因此，自噬是细胞的一种自我保护机制，它的作用受到多种因素的诱导和调节。其中，ROS-JNK 通路就是诱导和调节细胞自噬的一条重要通路。

3.1 通过影响Bcl-2磷酸化激活细胞自噬 研究发现，JNK1被ROS激活后可直接磷酸化Bcl-2蛋白，使Bcl-2从自噬关键蛋白Beclin 1上解离下来，Beclin 1被活化后可形成Beclin 1-Vps34-PI3K 多蛋白复合体，从而激活自噬。当使用JNK1 的抑制剂或外源性导入磷酸化位点突变的Bcl-2蛋白时，自噬被抑制；而结构性激活JNK1，则会引起Bcl-2的多位点磷酸化，导致自噬激活［19］。尽管Bcl-2和Bcl-xL 之间具有相似的结构及相同的磷酸化位点，但Beclin 1与Bcl-xL间的结合能不能受到JNK1介导的磷酸化调节目前仍不清楚［20］。

3.2 通过上调ATG7激活细胞自噬 Wang等［21］的研究表明，ROS-JNK 信号通路还可通过Beclin 1 非依赖的方式直接上调自噬关键基因ATG7与ATG5，激活细胞自噬。这一激活方式只存在于肿瘤细胞中，而在良性组织及正常细胞中不存在。

3.3 通过激活凋亡信号间接抑制细胞自噬 细胞凋亡与自噬是细胞的两种重要功能，对凋亡与自噬相互作用的研究是当前的一个热点。凋亡可以通过多种途径抑制自噬的发生，反之自噬亦可以抑制凋亡。在研究二者发生机制的过程中，研究人员发现信号分子（如JNK、Akt等）在二者信号通路中频繁交叉出现，提示着凋亡与自噬存在必然的联系［22］。ROS通过双特异性激酶JNKK（包括MKK4、MKK7）激活JNK，而激活的JNK又可以通过转录因子AP-1促进p53、Bax、Fasl、TNF等促凋亡蛋白的表达。高表达的促凋亡蛋白如Bax、Bak等作用于线粒体，可促使细胞色素C释放入胞浆，细胞色素C和caspase-9结合，最终作用于caspase-3，而使caspase-3 活化。活化的caspase具有十分重要的作用，它们可以裂解自噬相关蛋白，裂解的自噬相关蛋白可进入线粒体，促进细胞色素C 的释放而进一步促进细胞凋亡的发生。有研究表明，Beclin 1 可以被caspase-3裂解产生C端Beclin 1片段，它可进入线粒体内促进细胞色素C 的释放，抑制自噬，诱发凋亡［23］。另外，表达的Fasl、TNF等配体与细胞膜上的死亡受体（Fas、TNFR 等）结合形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex，DISC），DISC促进前体caspase-8裂解，生成活化的caspase-8，caspase-8一方面可以激活细胞凋亡的下游caspase，启动凋亡信号，另一方面可以诱导产生c-FLIP、v-FLIP 等物质与Atg3结合，从而抑制Atg3 和LC3 的结合，抑制细胞自噬的发生。用caspase-8的广谱抑制剂zVAD 处理小鼠L929纤维肉瘤细胞发现，zVAD 可以促进这细胞发生自噬性死亡，这表明细胞的凋亡信号受到抑制后，其自噬途径反而被激活。而进一步的研究发现，抑制caspase-8可能与ROS的产生及JNK 的激活关系密切［24］。

3.4 ROS-JNK 通路对自噬的调节作用依赖于细胞内ROS水平 ROS-JNK 通路既可介导细胞凋亡也可以介导细胞自噬，其关键在于细胞内的ROS 水平。适度水平的ROS 可导致JNK 信号短暂激活，通过Beclin1 途径诱导细胞自噬水平增加，但还不足以引起细胞凋亡。但当ROS超过一定水平后则会导致JNK 的持续激活，引起线粒体途径介导的细胞凋亡［25-26］。最近的研究发现，使用冬凌草甲素处理多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞可以诱导细胞内高水平的ROS产生，以及随之而来的细胞凋亡的增加和自噬抑制［27］。相反，低水平的ROS则可促进自噬、抑制凋亡。在低ROS水平（即基本氧化应激）下，JNK 可通过活化Atg7 介导细胞自噬的发生。研究证明，在基本的氧化应激下，敲除自噬相关基因Atg7 会显著降低药物引起的H2O2介导的细胞自噬反应，而进一步的研究提示ROS依赖的JNK 和ERK 的激活均是介导H2O2升高、促进自噬水平增加的重要上游调控机制［21］。

4 展 望

ROS的产生作为重要的第二信使参与多种生物学效应的启动，而ROS-JNK 通路作为细胞信号转导研究中备受关注的一条重要通路，参与了细胞增殖、分化、存活、死亡（凋亡为主，包括自噬性细胞死亡）等许多生命过程。在哺乳动物细胞内存在着ROS-JNK 通路直接或间接激活或调控细胞自噬的复杂机制，ROS的水平直接影响了这一过程。至于ROS-JNK 通路作用于自噬的结果及其对凋亡的影响，目前尚不明确，但最新的研究表明可能与ROS激活JNK 的途径等关系密切。总之，ROS介导JNK 信号通路的调控网络相当繁琐，不断深入研究ROS激活JNK 的实现过程以及ROS-JNK 激活自噬介导细胞存亡的作用机制，将有助于阐明与自噬相关的某些肿瘤性疾病的发病机制，为临床治疗提供更为有意义的研究方向。

［1］ Scherz-Shouval R，Elazar Z.Regulation of autophagy by ROS：physiology and pathology［J］.Tren Biol Sci，2011，36（1）：30-38.

［2］ Davis RJ.Signal transduction by the JNK group of MAP kinases［J］.Cell，2000，103（2）：239-252.

［3］ Ray PD，Huang BW，Tsuji Y.Reactive oxygen species（ROS）homeostasis and redox regulation in cellular signaling［J］.Cell Signal，2012，24（10）：981-990.

［4］ Soga M，Matsuzawa A，Ichijo H.Oxidative stress-induced diseases via the ASK1signaling pathway［J］.Int J Cell Biol，2012，20（12）：1301-1305.

［5］ Lee BC，Park BH，Kim SY，et al.Role of Bim in diallyl trisulfide-induced cytotoxicity in human cancer cells［J］.J Cell Biochem，2011，112（1）：118-127.

［6］ Fujino G，Noguchi T，Matsuzawa A，et al.Thioredoxin and TRAF family proteins regulate reactive oxygen species-dependent activation of ASK1 through reciprocal modulation of the N-terminal homophilic interaction of ASK1［J］.Mol Cell Biol，2007，20（3）：152-163.

［7］ Chen K，Vita JA，Berk BC，et al.c-Jun N-terminal kinase activation by hydrogen peroxide in endothelial cells involves src-dependent epidermal growth factor receptor transactivation［J］.J Biol Chem，2001，276（19）：16045-16050.

［8］ Fernández BG，Jezowska B，Janody F.Drosophila actin-Capping Protein limits JNK activation by the Src protooncogene［J］.Oncogene，2013，155（3）：210-213.

［9］ Rudrapatna VA，Bangi E，Cagan RL.A Jnk-Rho-Actin remodeling positive feedback network directs Src-driven invasion［J］.Oncogene，2013，23（2）：111-121.

［10］ Thévenin AF，Zony CL，Bahnson BJ，et al.GST pi modulates JNK activity through a direct interaction with JNK substrate，ATF2［J］.Pro Sci，2011，20（7）：834-848.

［11］ D′Autréaux B，Toledano MB.ROS as signalling molecules：mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（10）：813-824.

［12］ Zhao J，Jitkaew S，Cai Z，et al.Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3downstream component of TNF-induced necrosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（14）：5322-5327.

［13］ van den Berg MC，van Gogh IJ，Smits AM，et al.The Small GTPase RALA Controls c-Jun N-terminal Kinasemediated FOXO Activation by Regulation of a JIP1Scaffold Complex［J］.J Biol Chem，2013，288（30）：21729-21741.

［14］ Morgan MJ，Kim YS，Liu Z.Lipid rafts and oxidative stress-induced cell death［J］.Antioxid Redox Signal，2007，9（9）：1471-1483.

［15］ Kamata H，Honda S，Maeda S，et al.Reactive oxygen species promote TNFα-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases［J］.Cell，2005，120（5）：649-661.

［16］ Hou N，Torii S，Saito N，et al.Reactive oxygen speciesmediated pancreaticβ-cell death is regulated by interactions between stress-activated protein kinases，p38and cjun N-terminal kinase，and mitogenactivated protein kinase phosphatases［J］.Endocrinology，2008，149（4）：1654-1665.

［17］ Lornejad-Schfer MR，Schfer C，Schffl H，et al.Cytoprotective role of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1in light-damaged human retinal pigmentepithelial cells［J］.Phot Photobiol，2009，85（3）：834-842.

［18］ Choi AM，Ryter SW，Levine B.Autophagy in human health and disease［J］.N Eng J Med，2013，368（7）：651-662.

［19］ Wei Y，Pattingre S，Sinha S，et al.JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2regulates starvation-induced autophagy［J］.Mol Cell，2008，30（6）：678-688.

［20］ Levine B，Sinha S，Kroemer G.Bcl-2family members：dual regulators of apoptosis and autophagy［J］.Autophagy，2008，4（5）：600-606.

［21］ Wang CH，Iskandar KB，Yadav SK，et al.Simultaneous induction of non-canonical autophagy and apoptosis in cancer cells by ROS-dependent ERK and JNK activation［J］.PLoS One，2010，5（4）：e9996.

［22］ Moretti L，Cha YI，Niermann KJ，et al.Switch between apoptosis and autophagy：radiation-induced endoplasmic reticulum stress［J］.Cell Cycle，2007，6（7）：793-798.

［23］ Zhu Y，Zhao L，Liu L，et al.Beclin 1cleavage by caspase-3 inactivates autophagy and promotes apoptosis［J］.Protein Cell，2010，1（5）：468-477.

［24］ Chen SY，Chiu LY，Maa MC，et al.zVAD-induced autophagic cell death requires c-Src-dependent ERK and JNK activation and reactive oxygen species generation［J］.Autophagy，2011，7（2）：217-228.

［25］ Liu J，Lin A.Role of JNK activation in apoptosis：a double-edged sword［J］.Cell Res，2005，15（1）：36-42.

［26］ Tang D，Kang R，Zeh HJ 3rd，et al.High-mobility group Box 1，oxidative stress，and disease［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14（7）：1315-1335.

［27］ 曾蓉，陈燕，崔国惠.抑制自噬促进冬凌草甲素诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡涉及胞内ROS产生［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（4）：296-300.