EB病毒对树突状细胞影响的研究进展＊

王 红 综述，温文胜审校

（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 530021）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是Epstein和Barr于1964年首次成功地在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞，是多种恶性肿瘤（如鼻咽癌、胃癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等）的病因之一。树突状细胞（DC）是目前所知的功能最强的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC），能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟树突状细胞（immature dentritic cell，imDC）具有强大的抗原摄取能力，是机体免疫应答的主要启动者，在机体的免疫应答过程中发挥着极其重要的作用。机体局部imDC 的数量与肿瘤的发生发展有密切的关系。在鼻咽部非角化癌中，imDC 主要分布于癌巢内；得出结论癌巢内imDC 的数量与鼻咽部非角化癌TNM分期及淋巴结转移有关。而成熟DC 能有效激活初始型T 细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

当机体被EBV 感染后，病毒长期以环状DNA 形式游离在淋巴细胞质中，并整合在染色体内，当机体免疫功能低下时，EBV 活化形成，造成复发感染。DC既然处于免疫应答的中心环节，EBV 若通过多种途径影响DC的存活、状态及功能，便可导致免疫应答环节减弱或断裂，从而形成EBV 在体内的免疫耐受和免疫逃逸。EBV 对DC的影响如何，本文就此主题作简要综述。

1 EBV 感染对DC数量的影响

DC广泛分布于脑以外的全身组织和脏器，数量较少，仅占人外周血单个核细胞的1%。当利用人外周血单个核细胞诱导DC时，研究者用EBV 感染新生儿脐带血单核细胞诱导产生的DC证实：在单核细胞向DC 分化过程中，经EBV 感染的病毒组与正常未感染对照组比较，病毒组细胞出现凋亡形态学特征（如染色质凝集）改变，凋亡细胞数明显增多，Western blot检测结果显示连锁凋亡抑制蛋白（X linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）表达下调，caspase-3酶活性显著增高。这些结果提示，在脐带血单核细胞向DC 分化过程中，EBV 通过上调caspase-3活性，下调XIAP 表达而诱导DC凋亡［1］。同样的，有学者使用Western blot的方法检测XIAP 和caspase-3、8、9的活性来研究EB病毒对从脐带血单核细胞分化产生的DC发育的影响，结果显示，EBV 感染组的caspase-3、9的活性增强，XIAP的表达下调［2］。众所周知，caspases是一个天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族，能通过介导凋亡和炎症来调节细胞［3］。caspase-3和caspase-7 具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解PARP，DNA 断裂因子45（DNA fragmentation factor-45，DFF-45），导致DNA 修复的抑制并启动DNA 的降解。caspase-8表达缺失是胚胎致死性因素，并且它能抑制细胞坏死，促进分化和免疫信号、调节自我吞噬及促进细胞迁移［4］。由此可推断，在受到EBV 感染后，EBV 可通过改变DC中凋亡相关的酶和基因来诱导DC 凋亡增加，从而使成熟DC数量减少。

2 EBV 感染对DC特性的影响

2.1 DC形态和大小的改变 DC 的形态、大小与其功能和成熟度相关，DC的“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成，扩大了DC细胞的膜结构，是有效捕获抗原的结构基础。成熟的DC拥有许多面纱样表面凸起，形成伪足，肌成束蛋白1（fascin1）能促使成熟的DC 从外周组织迁移至淋巴结呈递抗原信息给T 细胞［5］。虽然DC在免疫中有重要作用，并且被用于肿瘤的免疫治疗，但是这些细胞却能被肿瘤的免疫抑制作用调节［6］。90%的鼻咽癌（NPC）患者曾经感染过EBV，用NPC患者的外周血分离出的单核细胞诱导DC，在光镜下观察到NPC组外周血单核细胞经细胞因子干预后出现有突起细胞时间较晚。DC在培养后的第2、3天，有突起的细胞虽然形态不规则，也聚集成簇状，但细胞数及突起数较少，体积较小；在第8～10天的培养末期，仍有部分有突起的DC成不规则的形态，不悬浮，圆形、悬浮的成熟DC 数量较少。人们观察到病毒组细胞出现皱缩，形态变圆，与邻近细胞分离，细胞漂浮增多，细胞的形态也逐渐变得模糊。在培养的第7天Hoechst33258染色可见，对照组细胞核大而均质，淡蓝染色；病毒组细胞核固缩、碎裂，形态不规则，致密浓染，呈凋亡改变［7］。经EBV 感染后的DC为何会出现这些改变？是什么导致了DC形态和大小的改变？有研究者提出：随着培养时间的延长，EBV 感染组的caspase-3活性逐渐升高，caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的最终效应分子，在凋亡早期被激活，可特异性地切割不同底物，降解细胞核、细胞质及细胞骨架的重要蛋白质［8］。通过对神经元轴突树突棘的精细结构的观察和研究，得出结论轴突外形改变的结果来自于对肌动蛋白细胞骨架的改变。丝切蛋白的磷酸化作用不能使纤维状肌动蛋白解聚，而这能稳定肌动蛋白细胞骨架［9］。微管网状物和肌动蛋白细胞骨架的结构和功能与T 细胞的活性、迁移性和细胞表面功能相关［10］。通过对DC微观流变学特性研究显示：DC 的变形能力还与细胞骨架微丝蛋白的表达量有关。研究者用激光共聚焦显微镜观察发现，在分化过程中，DC 的纤维状肌动蛋白的表达量逐渐下降，可能导致细胞膜缺乏细胞骨架的支撑而导致细胞的变形能力增加［11］。DCs在其复杂的生命过程中显示出不同的免疫学功能和微观流变学特性，而且肿瘤来源的抑制性细胞因子能够通过损伤DCs的微观流变学特性来抑制其免疫功能。DC 形态和活动性的变化与其基础功能密切相关，但是，具体EBV 是通过影响DC的哪些超微结构造成DC 形态上的改变还未见有报道。

2.2 DC表面标志的变化 一般在机体免疫应答过程中，DC感受到病原微生物刺激后，分泌大量细胞因子包括IL-12、IL-10等，从而对其他免疫细胞产生调控作用，同时自身高表达抗原递呈相关分子及共刺激分子，如MHC（HLA）、CD80、CD86、CD40等，从而更加有效地加工递呈抗原，活化T 细胞，触发获得性免疫应答。DC 在天然免疫和获得性免疫之间发挥着重要的中枢桥梁作用，因此其成熟和功能状态也是免疫学研究的热点［12］。有大量的文献报道，机体在受到EBV 感染后与正常对照组相比，成熟DC的摄取抗原相关的表面标志和抗原提呈随后启动适应性免疫应答相关的免疫标志发生改变，如：由EBV 感染的外周血单核细胞分化来DC或是EBV 感染外周成熟DC能够高表达共刺激因子（如CD40，CD80和CD86），但是未成熟的DC的表型区别与免疫耐受和内稳态相关［13］。在实验中病毒组与对照组相比，DC 表面CD14下调延迟，HLA-DR和表面协同刺激分子CD86表达上调被抑制［14］。耐受性树突状细胞因低表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86 等免疫活性因子诱导T 细胞克隆无能或低反应性，还能诱导调节性T 细胞大量扩增从而形成免疫耐受［15］。生理状态下的未成熟树突状细胞表现出耐受性DC的免疫特征，可以作为Treg 的上游细胞，通过分泌IL-10诱导Treg 的产生，从而诱导免疫耐受［16］。但目前存在的问题是树突细胞肉瘤自身稳定性差，易受周围细胞因子环境刺激失去其原有的免疫耐受效能。EBV 通过改变树突细胞肉瘤的周围环境而引起DC 在成熟过程中发生细胞表面标志的变化从而影响DC的成熟及功能，当然产生这些变化的机制还有待进一步研究。

3 EBV 感染对DC功能的影响

3.1 抗原的处理与呈递 DC 是体内最重要的抗原递呈细胞，具有摄取、处理和提呈抗原至T 细胞的功能。EBV 的Bcrf1编码框和人类IL-10同源，具有和IL-10相似的免疫抑制作用［17］。DC的表型和功能在很大程度上受到IL-10的影响，高度保守的IL-10 基因已经在包括EBV 在内的许多大分子DNA 病毒中找到，且分离表达了EBV 开放阅读框基因BCRFI，实验证实其与人类IL-10基因同源。EBV 编码的IL-10蛋白与人IL-10有84%的一致性，在IL-10的长期作用下可使DC高表达HLA-DR，这类新的细胞叫IL-10APC，能够减弱活化CD4＋T 细胞的功能。有研究者用EBV 感染DC，发现产生Ⅰ型干扰素需要TLR 信号的激活，同时说明了EBV 是通过机体的自体吞噬机制来使类浆细胞DC 产生Toll样受体（TLR），然后被EBV 感染的DC 能通过病毒与HLA-DR 捆绑让DC表达EBV 潜伏基因［18］。受到EBV 感染的成 熟DC 能降低IL-12的分泌水平，以及上调IL-10的分泌，有助于免疫主体的保护和病原体的免疫逃避［13］。有研究者总结出EBV 发生免疫逃避的机制，是通过诱导抑制MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类抗原的表达、损伤DC功能、下调共刺激分子、激活病毒特异性调节T 细胞和诱导抑制性细胞因子的产生［19］。由此可推测，EBV 能逃避DC 把其作为异质的识别，继而机体不对EBV 发生免疫攻击，EBV 便可潜伏在体内，实现EBV 的免疫耐受和免疫逃逸。

3.2 参与胸腺内T 细胞的发育、分化和激活 众所周知，DC对T 细胞的分化起着重要作用，如：DC 分泌的IL-12可诱导Th1细胞分化；在缺乏CD8＋T 细胞时，DC 可诱导CD4＋T 细胞发育为CD8＋T 细胞。DC 高表达多种协同刺激分子（尤其是B7分子），可通过其与T 细胞表面相应受体结合，提供T 细胞激活的协同刺激信号。此外DC 还可分泌多种细胞因子参与T 细胞的增殖。EBV 能通过降低单核吞噬细胞表面HLAÑ、ICAM-1和B7的表达，抑制其抗原提呈功能而逃逸T 细胞的监视［20］。DC与T 细胞之间是相互作用的，EBV 感染的外周血单核细胞分化成的DC，有赖于调节T 细胞的发育情况，如Foxp3、CTLA-4的表达上升，GITR 的表达下调，以及能在细胞内分泌IL-2和IL-10的调节性T 细胞的产生［15］。T 细胞的各个亚群有着自己独特的专一的转录因子控制其分化和功能，DC细胞中，到目前为止，还未发现一个在DC 中特异性表达且对T 细胞的分化和功能起到关键调控作用的生物分子。

3.3 参与B细胞的发育、分化和激活 外周淋巴器官B细胞依赖区的滤泡树突状细胞（FDC）不表达MHC-Ⅱ类分子，而表达大量的FcR 和补体、受体，这些受体可结合免疫复合物，但不发生内吞。免疫复合物可在FDC 表面长期保存，并向B 细胞提供抗原信号及共刺激信号，诱导Ig类别转换、亲和力成熟和免疫记忆。但就外周血单核细胞来源的DC 而言，DC 是通过诱导初始T 细胞活化，从而辅助B 细胞发挥体液免疫功能的。有报道称EBV 刺激成熟的DC 能引出扁桃体NK 细胞分泌比其他外周血NK 细胞强5倍的IFN-γ，而NK 细胞产生的高浓度IFN-γ能延迟潜伏EBV 抗原的表达，结果就是在EBV感染后的第一周B细胞增殖减少［21］。实验表明，在扁桃体的特异性NK 细胞是EBV 进入黏膜的门户，可以有效地刺激EBV 激活的DC，然后限制EBV 诱导的B细胞的转换，直到免疫系统其他成分的建立而控制EBV 特异性的免疫。但EBV感染的DC对B细胞发育、分化和激活的具体机制仍不清楚。

3.4 免疫调节 DC是免疫应答的关键细胞，不仅可以激活淋巴细胞引发免疫效应，还能诱导免疫耐受以防止免疫反应失控，具有双向的免疫调节作用。DC 可分泌多种细胞因子发挥调节免疫功能的作用，如：IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α、INF-α和GM-CSF等。DC还可分泌多种趋化因子，以介导其他免疫细胞的趋化作用。DC可激活不同亚群的T 细胞或使Th细胞向不同方向分化，从而诱导不同类型的免疫应答。此外，成熟DC表达的FasL能诱导Fas＋淋巴细胞凋亡，参与免疫应答的调控。DC通过其模式识别受体（PRR）能够识别区分不同类别的病原体，PRR 与病原相关分子模式（PAMP）相结合，诱导适应性免疫反应。DC 表达的PRR 主要包括TLR、C 型凝集素受体（CLRs）、NOD 样受体（NLR）等，这些受体可以通过启动信号转导通路参与免疫调节［22］。而EBV 能编码外源性脱氧尿苷焦磷酸酶（EBV-dUTPase）改变人类DC中原癌基因的表达，且能改变炎症和病毒防御机制。这是由于EBV-dUTPase能引发DC和外周单核细胞中的NF-κB反应和细胞因子的分泌，并且能通过诱导TLR2依赖性的前炎性因子TH1／TH17的分泌来调节DC的免疫反应［23］。最近一个报道称已经证实EBV编码的dUTPases能通过激活TLR2和NF-κB 信号来调节先天免疫反应［24］。虽然，DC 能介导先天免疫通过pDCs产生的IFNα／β控制EBV 感染，并且通过IFN-γ激活NK 细胞，以及通过杀灭病毒容受细胞来消除EBV 裂解出的复制物［25］。最近的研究报道也称pDCs能调节MHC-Ⅰ类氨基酸复合物表达EBV 表位，这种交叉携带MHC-Ⅰ类复合物也能充分地刺激EBV 特异性CD8＋T 细 胞［26］。但是，EBV抑制了DC的吞噬功能，阻碍了DC的分化和成熟，使DC摄取处理抗原和提呈抗原的能力受损。MHC-Ⅰ类分子的降低导致在控制EBV 感染中发挥关键性作用的MHC-Ⅰ类分子限制性的CD8＋细胞毒性T 细胞功能受损。EBV 使DC 分泌抑制性细胞因子增加，抑制了宿主免疫，并且使免疫应答反应向Th2方向偏移，削弱了细胞免疫功能。

4 DC用于鼻咽癌的免疫治疗新进展

当前研究在免疫治疗上取得了一些成效，如：研究者已经在实验性研究中建立了腺病毒基础载体，被称为E1-LMP 多聚体，编码从LMP-1 到LMP-2 多种CTL 表位，缩短了EBNA1的无甘氨酸重复序列。他们的前期研究说明E1-LMP多聚体能用于扩增来自肿瘤患者的LMP1-、LMP2-和EBNA1-特殊T 细胞。他们还完成了一项E1-LMP多聚体疫苗作为复发性和转移性NPC 的治疗工具的正式临床评估，结果说明以E1-LMP多聚体为基础的细胞性免疫疗法可能对临床上转移性NPC患者有益［27］。NPC 患者在放疗后接种自体DC 疫苗与EBV 编码潜伏膜蛋白（LMP2A）多肽相关。EBV-特异性HLA-A2-限制性DC疫苗是潜在的EBV-相关的NPC 治疗方法［28］。用经过腺病毒去顶端的潜伏膜蛋白1（ΔLMP1）和全长LMP2（Ad-ΔLMP1-LMP2）编码的自体DC 接种患者，以此来评估腺病毒-ΔLMP1-LMP2转染的DC 疫苗在转移性NPC 患者治疗中的安全性和有效性，结果显示：该方法能成功安全应用于恶性NPC患者，但成效有限［29］。但是，目前的免疫治疗还存在一些缺陷，如：（1）疗效不稳定，当为接受化疗后的NPC患者联合进行T 细胞灌注治疗，但是在开始诱导肿瘤衰退1个循环之后又迅速回归到了化疗之后的疾病状态。（2）基因转染后的DC表达不稳定，在临床研究中，经基因改变后的DC对T 细胞活性是足够的，但是它们不能提供持续性的共刺激能力来增加和维持免疫环境中的炎性因子，以及提供其他额外的补充［30］。以DC为基础的疫苗在临床前期的研究中展现出了优异的潜能，但是以后的研究需要注重提高它们的实用性。除此之外使用DC的免疫治疗还存在其他方面的问题，如：抗原负载DC的最佳形式、DC肿瘤疫苗在肿瘤免疫治疗的最佳靶点，以及DC临床应用的规范化问题和安全保证等。

5 结 语

结合本文综述，EBV 能够全方位地影响DC 数量、形态和功能，由于EBV 是多种恶性肿瘤的病因之一，这不得不让研究者们思考该如何通过DC 来改进恶性肿瘤性疾病的免疫治疗方法。通过本文论述，由DC参与的免疫疗法可以作为一个新的平台，探索结合化疗在复发或转移性恶性疾病上潜在的治疗效果，以及作为一个减少高危患者发病风险潜在的预防策略，EBV-目标性免疫治疗是一个可发展的新颖治疗策略。当机体被EBV 感染后，病毒通过多种途径影响DC 的存活、状态及功能，导致免疫应答环节减弱或断裂，从而形成EBV 在体内的免疫耐受和免疫逃逸。因此可以考虑从切断EBV 感染DC；异体非EBV 感染者DC疫苗输入；干扰EBV 在DC 中的复制及功能表达等方面来解决EBV 造成的免疫耐受和免疫力下降等问题。若能成功对抗EBV 对DC 的各项负面作用，在EBV 引起的恶性肿瘤的免疫治疗上将是一项较大的突破。

［1］ 金莹莹，王玺，陈同辛.EB病毒对脐带血单核细胞来源树突状细胞凋亡的影响［J］.上海交通大学学报：医学版，2010（2）：121-124.

［2］ Wang JJ，Li YF，Jin YY，et al.Effects of Epstein-Barr virus on the development of dendritic cells derived from cord blood monocytes：an essential role for apoptosis［J］.Braz J Infect Dis，2012，16（1）：19-26.

［3］ Murray J，Renslo AR.Modulating caspase activity：beyond the active site［J］.Curr Opin Struct Biol，2013，23（6）：812-819.

［4］ Graf RP，Keller N，Barbero S，et al.Caspase-8as a regulator of tumor cell motility［J］.Curr Mol Med，2014，14（2）：246-254.

［5］ Yamakita Y，Matsumura F，Lipscomb MW，et al.Fascin1 promotes cell migration of mature dendritic cells［J］.J Immunol，2011，186（5）：2850-2859.

［6］ Chao PZ，Hsieh MS，Cheng CW，et al.Dendritic cells respond to nasopharygeal carcinoma cells through annexin A2-recognizing DC-SIGN［J］.Oncotarget，2015，6（1）：159-170.

［7］ 王娟娟，金莹莹，王玺，等.EB 病毒对脐带血单核细胞向树突状细胞分化过程中凋亡的影响［J］.现代免疫学，2010，30（5）：384-389.

［8］ Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2005，37（11）：719-727.

［9］ Frotscher M，Studer D，Graber W，et al.Fine structure of synapses on dendritic spines［J］.Front Neuroanat，2014，8：94.

［10］ Ritter AT，Angus KL，Griffiths GM.Griffiths，The role of the cytoskeleton at the immunological synapse［J］.Immunol Rev，2013，256（1）：107-117.

［11］ Zeng Z，Liu X，Jiang YH，et al.Biophysical studies on the differentiation of human CD14（＋）mono cytes into dendritic cells［J］.Cell Biochem Biophys，2006，45（1）：19-30.

［12］ 王品.非编码RNA 对人NK 细胞与树突状细胞免疫功能的调控作用及相关机制研究［D］.上海：第二军医大学，2013.

［13］ Jin YY，Wang X，Du J，et al.Epstein-Barr virus induces the differentiation of semi-mature dendritic cells from cord blood monocytes［J］.Hum Immunol，2014，75（4）：306-316.

［14］ Guerreiro-Cacais AO，Li L，Donati D，et al.Capacity of Epstein-Barr virus to infect monocytes and inhibit their development into dendritic cells is affected by the cell type supporting virus replication.［J］.J Gen Virol，2004，85（5）：2767-2778.

［15］ Yamazaki S，Inaba K，Tarbell KV，et al.Dendritic cells expand antigen-specific Foxp3＋CD25＋CD4＋regulatory T cells including suppressors of alloreactivity［J］.Immunol Rev，2006，212（1）：314-329.

［16］ 李颖，徐林.CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T 细胞研究的新进展［J］.现代免疫学，2010（06）：520-523.

［17］ 王慈，潘凌，朱平.淋巴系统肿瘤发病与EB病毒和IL-10基因多态性的关系［J］.中国实验血液学杂志，2011（2）：528-531.

［18］ Severa M，Giacomini E，Gafa V，et al.EBV stimulates TLRand autophagy-dependent pathways and impairs maturation in plasmacytoid dendritic cells：implications for viral immune escape［J］.Eur J Immunol，2013，43（1）：147-158.

［19］ Hu Z，Usherwood EJ.Immune escape of-herpesviruses from adaptive immunity［J］.Rev Med Virol，2014，24（6）：365-378.

［20］ Salek-Ardakani S，Arrand JR，Mackett M.Epstein-Barr virus encoded interleukin-10 inhibits HLA-class I，ICAM-1，and B7expression on human monocytes：implications for immune evasion by EBV［J］.Virology，2002，304（2）：342-351.

［21］ Strowig T，Brilot F，Arrey F，et al.Tonsilar NK cells restrict B cell transformation by the Epstein-Barr virus via IFN-gamma［J］.PLoS Pathog，2008，4（2）：e27.

［22］ 盛康亮，张玲玲，魏伟.树突状细胞参与免疫调节的相关受体及其介导的信号转导通路研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（9）：997-1000.

［23］ Ariza ME，Rivailler P，Glaser R，et al.Epstein-Barr virus encoded dUTPase containing exosomes modulate innate and adaptive immune responses in human dendritic cells and peripheral blood mononuclear cells［J］.PLoS One，2013，8（7）：e69827.

［24］ Ariza ME，Glaser R，Williams MV.Human herpesvirusesencoded dUTPases：a family of proteins that modulate dendritic cell function and innate immunity［J］.Front Microbiol，2014，5：504.

［25］ Munz C.Dendritic cells during Epstein Barr virus infection［J］.Front Microbiol，2014，20（5）：308.

［26］ Bonaccorsi I，Morandi B，Antsiferova O，et al.Membrane transfer from tumor cells overcomes deficient phagocytic ability of plasmacytoid dendritic cells for the acquisition and presentation of tumor antigens［J］.J Immuno，2014，192（2）：824-832.

［27］ Smith C，Khanna R.A new approach for cellular immunotherapy of nasopharyngeal carcinoma［J］.Oncoimmunology，2012，1（8）：1440-1442.

［28］ Li F，Song D，Lu YE，et al.Delayed-type hypersensitivity（DTH）immune response related with EBV-DNA in nasopharyngeal carcinoma treated with autologous dendritic cell vaccination after radiotherapy［J］.J Immunothe，2013，36（3）：208-214.

［29］ Chia WK，Wang WW，Teo M，et al.A phase Ⅱstudy evaluating the safety and efficacy of an adenovirus-DLMP1-LMP2transduced dendritic cell vaccine in patients with advanced metastatic nasopharyngeal carcinoma［J］.Ann Oncol，2012，23（4）：988-997.

［30］ Boudreau JE，Bonehill A，Thielemans K，et al.Engineering dendritic cells to enhance cancer immunotherapy［J］.Mol Ther，2011，19（5）：841-853.