内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因与藏鸡低氧适应机制的研究

刘玲燕,兰 茜,朱 庆

(四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室”，雅安 625014)

内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因与藏鸡低氧适应机制的研究

刘玲燕,兰 茜,朱 庆*

(四川农业大学“畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室”，雅安 625014)

内皮一氧化氮合酶(eNOS)作为调控血管舒张因子NO生成的限速酶，对维持机体NO平衡和适应低氧环境具有重要作用。长期生活在高海拔低氧地区的藏鸡，形成了一套独特的低氧适应机制。作者就eNOS基因结构、编码产物特征和功能进行了综述，并对藏鸡eNOS基因参与低氧适应的遗传机制进行探讨，以期为家禽起源、进化、育种等工作提供借鉴。

藏鸡；低氧适应；NO；eNOS

藏鸡(Tibetan chicken)是全世界生活在高海拔地区历史最长的鸡种，它具有耐粗饲，抗病力强，肉味美，蛋营养价值高等特点，是中国高海拔地区发展养鸡业不可缺少的品种，是开发西藏优质、特色禽产品的良好资源[1]，其机体已经形成了低氧适应的遗传机制。内皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthases，eNOS)在低氧适应机制中发挥重要的作用，低氧可通过转录水平、翻译水平和翻译后水平多种模式调节eNOS的功能[2]。eNOS主要分布在脉管系统的内皮组织，它的结构包括N端的氧化结构域和C端的还原结构域，只有两个eNOS单体形成活性的异二聚体结构才能催化L-精氨酸生产NO[3]。在生理条件下由eNOS产生的少量NO能够维持生物体正常的生理功能，包括血管紧张度，血压，血管平滑肌细胞的增殖和抑制血栓形成等[4-5]，同时，研究表明低氧会刺激机体产生更多的eNOS和NO[6]，以增大呼吸量，调节血压和氧含量，这可能是eNOS的表达量与低氧适应有关的主要原因。对藏鸡eNOS基因的研究有助于为家禽起源、进化、育种等工作提供借鉴。

1 eNOS 基因及其编码产物

eNOS在不同物种中位于不同染色体上，人类的eNOS(NC_000007.13)位于7号染色体；家鼠的eNOS(NC_000071.6)位于5号染色体，鸡的eNOS(NC_006089.3)位于2号染色体，全长10.7 kb，通过可变剪接可形成7个独特的mRNA转录本(JQ434754.1、JQ434755.1、JQ434756.1、JQ434757.1、JQ434758.1、JQ434759.1、JQ434760.1)，其长度在3 000 bp左右；其中的一个转录本1(JQ434754.1)长度为3 310 bp，起始密码子和终止密码子分别位于281—283 bp和3 236—3 238 bp，编码合成985个氨基酸残基，蛋白质相对分子质量约为110 ku；哺乳动物中，eNOS基因核酸序列和蛋白质序列相似性分别为86%～99%和91%～99%。而鸡的eNOS的cDNA序列和蛋白质序列与哺乳动物序列相比分别有72%～77%和71%～72%的相似性[7]。

内皮型一氧化氮合酶是一氧化氮合酶(NO synthases ，NOS)家族的成员之一，NOS共有4个亚型，包括神经元型NOS(neuronal NO synthases，nNOS)、内皮型NOS(endothelial NO synthases，eNOS)，诱导型NOS(inducible NO synthases，iNOS)和线粒体NOS(mitochondrial NO synthases，mtNOS)。以哺乳动物为例说明功能结构域，N端是一个包含亚铁素、L-精氨酸和四氢生物嘌呤(tetrahydrobiopterin，BH4)结合位点的氧化酶域(氨基酸1-491)，C端是一个含黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和钙调素(calmodulin，CaM)结合位点的一个还原酶域(氨基酸492—1 205)[8-9]。在NO合成中，还原酶域中的NADPH得到电子，并转给其余的电子受体，最终通过FMN再转给氧化酶域的亚铁素，亚铁素得到电子后，能够绑定O2并刺激L-精氨酸产生NO[10]。

2 eNOS的高海拔适应功能

周锦等[11]的研究表明敲除eNOS基因(eNOS-/-)的小鼠显示出低氧肺血管结构重塑和肺动脉高压，而吸入NO能有效地缓解这些症状[12]；转入eNOS基因的转基因小鼠不仅可以抑制由低氧引起的肺动脉压增高，也可以抑制由低氧引起的肺小血管结构重塑[13]。具有eNOS缺陷的小鼠也更容易患高海拔水肿。有研究者发现，在高海拔肺水肿病人中，NO的水平减少，而藏人、艾玛拉人[14]和拉达克人[15]在他们呼出的气体和循环血液中具有较高水平的NO。此外，在对日本民众的研究发现，高海拔肺水肿易感性与eNOS的多态性有关[16]。这些研究支持了高水平的NO和eNOS具有高海拔的适应作用，同时也表明了对低氧的敏感性是有遗传基础的。此外，相较于健康鸡，饲养在高海拔的患肺动脉高压鸡的肺组织eNOSmRNA转录量和肺动脉内皮细胞eNOS的表达都更低，而较低的eNOS表达与平滑肌增厚有关[17]。

3 eNOS 基因在藏鸡低氧适应性中的研究进展

eNOS基因的研究已涉及生长、代谢以及病理学等领域，随着eNOS在低氧适应中的重要作用逐渐被人们接受，人们也对藏鸡的低氧适应机制进行了探索。

尽管来自人类、小鼠、牛、猪和其他哺乳动物的eNOS基因的cDNA序列在20世纪末已经被克隆，但是鸡的eNOS基因直至2012年才被完全鉴定或克隆。作为调节血管舒张素NO生成的限速酶，eNOS基因在其低氧适应中发挥着重要作用。研究表明，低氧条件下，低地鸡与藏鸡胚胎孵化过程中不同组织的eNOS的mRNA表达丰度存在差异，这可能与藏鸡的低氧适应有关[7]。

3.1 藏鸡呼吸系统eNOS与低氧适应机制的研究

胚胎发育是一个动态的过程，它不仅仅由生物体遗传背景决定，还由所处的环境决定[18]。通过比较在低地饲养的藏鸡和寿光鸡的胚胎eNOS的 mRNA表达发现，无论是低氧还是常氧，藏鸡肺组织中eNOS的表达显著高于寿光鸡[7]。此外，张浩等[19]研究也表明，在低氧条件下，藏鸡和低地鸡的肺组织eNOS酶活力比生活在低海拔时明显增加；但无论在低海拔还是在高海拔时，藏鸡eNOS酶活力都比低地鸡高，尤其在高海拔，差异更加明显。同时，H.Zhang等[20]研究了低氧对孵化性能的影响，结果表明，具有不同低氧适应遗传背景的藏鸡和矮小型鸡，在2 900 m海拔上孵化，无论是孵化率，胚胎重还是鸡重，藏鸡都比矮小型鸡高出一倍；补充O2后，矮小型鸡的孵化率大大提高。说明O2不足是导致低地鸡在2 900 m海拔孵化率低和小鸡质量差的主要因素，藏鸡肺组织eNOS酶的高表达和高活力可能是其适应低氧的重要因素之一。

3.2 藏鸡血管系统eNOS与低氧适应机制的研究

在血管系统中，虽然eNOS一直被认为主要存在于血管内皮细胞，但是后来P.Kleinbongard等[21]运用免疫荧光聚焦显微镜、WB等方法，证实了人的每个红细胞中都存在eNOS蛋白，而且在红细胞功能中发挥重要作用，并证实了eNOS蛋白存在于细胞膜内面和细胞液。这一发现使eNOS的定位得到补充，同时对eNOS在氧运输和血液动力学方面开辟新的领域。不过eNOS的mRNA是否在红细胞中表达仍存在争议[22]。而无论是藏鸡还是低地鸡，红细胞中是否存在eNOS的表达，还未曾见报道。

藏鸡和低地鸡血液生理生化指标的研究可能解释eNOS在红细胞中的存在。张浩等[23]研究表明，与矮小隐形白羽肉鸡相比，藏鸡的血液体积、红细胞体积和血浆体积都更低，可能说明了鸡红细胞中存在eNOS蛋白且藏鸡红细胞中的eNOS酶活力比低地鸡强；但是也有许多生活在高海拔的动物具有更高的血液体积或红细胞体积的报道[24-25]，这是否表明了鸟类与哺乳动物在血液生理方面具有不同的低氧适应机制还有待证实。在低氧刺激下，藏鸡血液红细胞数目升高，平均红细胞体积降低，红细胞的表面积扩大，更有利于血红蛋白绑定氧，提高血红蛋白运输氧的效率；同时也可能是低氧刺激红细胞中eNOS蛋白增加，血管扩张，更有利于对低氧的适应。饲养在高海拔的藏鸡能一直维持高水平的红细胞数目和稳定的血细胞比容值，而饲养在高海拔的矮小隐形白羽肉鸡随着年龄增长，红细胞数和血细胞比容逐渐增加。这些结果表明在低氧环境下，藏鸡拥有高水平的红细胞数量是遗传适应机制，而矮小型隐形白羽肉鸡增加的红细胞数量是对低氧的生理补偿性反应。其他研究也证实了藏鸡在遗传上具有更高的静脉CO2含量，血红蛋白浓度和血氧亲和力及更低的静脉pH值，这些血液生理指标是藏鸡对低氧的生理适应[26-27]。以上这些血液特点是否与eNOS的表达有关，还需要进一步研究确定。

4 结 语

总之，藏鸡能够适应高海拔低氧的环境是整个机体各系统的协调合作完成的，包括呼吸系统和血液循环系统。藏鸡各器官组织eNOS的表达特性可能是其在低氧环境生存的有利凭证。

藏鸡长期生活在高海拔地区，与外界的基因交流较少，形成了一套独特的遗传基础。虽然对其低氧适应机制的研究也在不断开展，但是研究的力度还远远不够。在哺乳动物中eNOS的结构、作用机制、病理学等领域的研究较多，较深入，但是在藏鸡中的研究程度还显得比较单薄。鉴于其低氧适应机制的研究晚于哺乳动物，其研究发展空间还很大，今后还需要对此进一步深入探讨，尤其是对eNOS基因的进化及其分布的探讨具有很大的研究价值。

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(编辑 白永平)

The Research of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene in Hypoxia Adaptation of Tibetan Chicken

LIU Ling-yan，LAN Xi，ZHU Qing*

(FarmAnimalGeneticResourcesExplorationandInnovationKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

As rate-limiting enzyme of regulating Nitric Oxide (NO) generation，endothelia nitric oxide synthase (eNOS) plays an important role to maintain the balance of NO，which is a vasodilatation factor.Life for a long time in high altitude hypoxic regions of Tibetan chicken，formed a unique mechanism of hypoxia adaptation.In this paper，the structure ofeNOSgene，coding product features and functions were reviewed，meanwhile，eNOSgene of Tibetan chicken involved in genetic mechanism of hypoxia adaptation are discussed，in order to provide help for the researches of origin，evolution，breeding of poultry，etc.

Tibetan chicken；hypoxic adaptation；NO；eNOS

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.003

2014-06-18

刘玲燕(1989-)，女，四川南充人，硕士生，主要从事家禽遗传育种与繁殖方面的研究，E-mail:liulingyan_602@163.com

*通信作者：朱 庆，E-mail:zhuqing5959@163.com

S813.1

A

0366-6964(2015)02-0192-04