标准化无菌及支原体检验培养基应用试验

李倩

（哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069）

标准化无菌及支原体检验培养基应用试验

李倩

（哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069）

经灵敏度检查合格的标准化无菌及支原体检验培养基已经在4个生物制药公司进行应用实验并且投入使用，分批进行抗原检测，99.5%的培养基经试验检测未被污染，可以投入使用。本文围绕这种无菌及支原体检验培养基进行研究分析，从材料和方法入手，最终进行检测实验以及方法探讨。

无菌；支原体检验；培养基

支原体是一种常见于生物制品中的污染微生物，它的污染不像细菌或者真菌那样容易被肉眼看见，所以在其培养时也很难被观察，这样就需要我们配置适宜的培养基。支原体对生长条件的要求比较严格，比如对营养条件的要求，对温度，湿度，pH的要求。由于这个原因，支原体的检验培养基一直是从事此方面工作人员难以解决的问题，下面我们就一起来分析研究本实验的培养基检验试验，具体情况如下:

1　材料

葡萄糖，乳蛋白水解物，25%酵母浸出物，1%L-半肤氨酸10.0mL，10%精氨酸，血清（本实验室采集），NaCl，KCl等盐，PPLO肉汤粉等；本实验用的所有类型的水都是北京某生物制药厂生产的，都是经过国家药品检测而达到标准的水质，其他实验材料也都是经过有关部门质量检测的。而本实验的支原体检验培养基在制备时，完全按照国家制定标准完成，有质量的保障。

2　方法

2.1培养基的制备无菌检验培养基：需要用到的材料有硫乙醇酸盐、酪陈琼脂和葡萄糖蛋白陈干粉。对这些材料进行简单的处理。将这三种材料的培养基分别按照9mL/支，6mL/支，7mL/支进行封装，之后采用高温高压法进行灭菌，控制适当的时间，准备为后期试验所用。

支原体检验培养基：主要原料有：一定量的PPLO肉汤粉和葡萄糖，25%酵母浸出液100.0mL，10%精氨酸20.0mL，10倍浓缩MEM溶液10.0mL，血清，青霉素（8万IU/mL）10.0mL蒸馏水。配制后调节培养基pH，使之维持弱碱性，采用适宜的方法去除杂菌的污染，然后在-20℃条件下进行保存。所用的固体培养基就是在此基础上加入适量的琼脂，使培养基呈现固态，但培养基的成分及含量基本保持不变。

2.2支原体检验培养基的应用试验培养基的配制的成功与否要看培养基培养支原体的情况以及支原体生长的情况。本实验选用猪鼻支原体（BTS-7）进行试验，试验的方法为：将培养基依次稀释10倍到10-3，10-4，10-5，一直依次递减，再将支原体加入其中，将其置于适宜温度下培养4～5d，当其中一组试验的培养基的颜色出现明显变化时停止试验，即为试验终点，记录实验数据，进行后期分析。

2.3培养基的保存试验用控制变量的方法，对培养基进行保存的检测试验。先取5支试管，分别加入等量且适宜的培养基，放入-20℃恒温箱中保存，记为第1组；再取5支试管，加入与第1组等量的培养基，放入37℃的恒温箱里保存，记为第2组。将两组的五支试管分别保存1d，2d，3d，4d，5d。前两组在保存规定时间后，将培养基与室温温度相同时，直接进行上述检测试验。而我们设置的第3组实验则是将相同量的5支试管的培养基先进行-20℃保存0.5d，1d，1.5d，2台，2.5d，再保存在37℃下相应的天数，进行这种冰冻-融化处理，在进行检测，记录试验的结果。

3　结果

从支原体检验培养基的试验中可以看出，这种配置方法的培养基浓度对于支原体培养的影响不大，先出现颜色变化的培养基也是随机的，而对所有参加检测的抗原，非禽源支原体检验培养基抽检样品，其中包括疫苗，细胞培养上清液等，血清支原体检验培养基抽检血清样品，他们在无菌培养基检测的结果一致。均没有污染情况产生。而经过培养基的保存试验可以得出结论，从支原体的生长速度可以看出，培养基在低温和适度高温，以至缓冻的条件下都可以保持较高的稳定性，支原体活菌滴度平均达到109/mL，营养条件保持良好，pH值没有明显变化，各个微量元素的含量无明显变化，且批次之间没有差异。

4　讨论

将培养基进行一定的改良，可以确保培养基的质量，提高检验工作的效率。由于支原体检验培养基对于培养条件要求特别严格，所以在配制时应注意改良方法。影响其质量的条件因素有很多，通常情况下一般的影响因素有温度，湿度以及培养时氧气的浓度。温度主要能够影响支原体的存活状况，温度过高将使支原体无法正常正常生存繁殖，温度过低则又会使支原体处于休眠状态，所以控制培养时的温度是十分重要的。湿度对支原体培养的影响也是较为显著的，湿度强度会直接影响到支原体的生长。培养过程中氧气浓度不仅会影响支原体的生长速度，还可能有助于其他的杂菌生长，导致支原体的培养失败。在支原体的培养过程中要对培养的温度、湿度及氧气浓度都要进行严格的控制，只要这样才能进一步保证支原体培养的成功。

5　结语

本文对标准化无菌及支原体检验培养基应用试验进行分析研究，改进了支原体检验培养基的配制，使它的更易保存，不易被污染。长期以来支原体培养检验的培养基的原料质量一直没有统一的标准，但通过大量的试验研究总结了对于配制培养基的配制更有利的各原材料的质量参数配比。避免了因培养基质量而带来的各种实验误差，提高了支原体检验工作的准确性。而且试验中对于培养基保存条件的实验更是进行了深入研究，模拟了各种情况下的保存，这为支原体检验培养基的储存和运输起到了很好的作用。

［1］张瑞婷，等.兽用生物制品的支原体污染检验及注意事项［J］.中国兽药杂志2012，35（2）:28-30.

［2］罗玉峰，等，标准化无菌及支原体检验培养基应用试验［J］.中国兽药杂志，2012，43（6）:26-29.

［3］罗玉峰，等.兽用药品无菌检验用硫乙醇酸盐培养基的研究［J］.中国兽药杂志，2011，43（4）:28-29.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.017