外泌体与心血管疾病研究进展

陈家显综述，桂庆军审校

（1.南华大学附属第二医院心血管内科，湖南衡阳421001；2.南华大学医学院，湖南衡阳421000）

外泌体与心血管疾病研究进展

陈家显1综述，桂庆军2审校

（1.南华大学附属第二医院心血管内科，湖南衡阳421001；2.南华大学医学院，湖南衡阳421000）

外泌体；干细胞；心血管疾病；综述

外泌体（exosomes）是一种由细胞内涵体网产生的膜性囊泡状结构小体，分为早期核内体和晚期核内体，可携带多种多肽类、生物活性脂质、核苷酸。其代谢过程广泛参与了体内生理和病理调节。国内外的很多证据表明，外泌体与心血管疾病发病机制关系密切，最近的研究证明，从缺血预调或各种干细胞中收集的外泌体能提供心肌保护作用，有潜在治疗心血管疾病的作用。本文主要综述外泌体在心血管疾病领域的研究进展。

1 外泌体的起源、分泌及分子组成

1.1 外泌体的起源 “外泌体”一词最初由Johnstone等[1]在研究网织红细胞成熟过程中囊泡的形成时提出。自从其首次发现之后，有很多关于外泌体起源的研究。外泌体是在内涵体网中产生的。早期的外泌体随着细胞膜内出芽过程的开始而形成，也称早期核内体（early endosomes，EE）；接着内胞膜二次内出芽形成各种管腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），即晚期的核内体，包含ILVs的后期核内体，也被称为多泡体（multivesicular bodies，MVBs）；最后，MVBs与细胞膜融合，以胞吐的形式向细胞外环境释放出ILVs，这些ILVs即外泌体；或MVBs移动到细胞核周围的区域与溶酶体直接融合，形成混合细胞器后被降解。目前，ILVs形成的分子机制与这些囊泡内部的蛋白质排列已部分明确。驱动MVBs形成进程的最佳描述机制是由内涵体分选复合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）系统协调的，这也广泛在近期发表的文章中被提到[2-5]。简而言之，该机制体系包含4种可溶性蛋白复合物，即ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ及其辅助蛋白。ESCRT-0负责以依赖泛素的形式装卸转运，ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ诱导出芽的形成，ESCRT-Ⅲ驱使囊泡分离，辅助蛋白（尤其是VPS4 ATPase）保障ESCRT机制体系的解离和再生循环。

1.2 外泌体的分泌 研究发现，外泌体可由多种细胞产生，包括树突状细胞、B淋巴细胞、干细胞、内皮细胞、上皮细胞，还可在多种体液中提取，如血液、尿液、精液（前列腺液）、羊水和胸腔积液中分离[6]。

不管外泌体的释放是在细胞中还是体液中，其分泌的最后一步都需要MVBs和细胞质膜进行融合。此进程可能与一个特定的可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子-联合蛋白受体（specific combination of soluble N-ethyl maleimide-sensitive factor-attachment protein receptors，SNAREs）联合物相关：SNAREs囊泡（v-SNAREs，位于MVBs上）与SNAREs靶标（t-SNAREs，位于质膜的细胞内一侧）相互作用，形成一种膜桥接的SNARE复合体以进行膜融合[7-8]。

1.3 外泌体的分子组成 许多证据表明，外泌体的组成包含DNA、RNA和蛋白质。常见的一套外泌体蛋白已被识别，其可在亲本细胞膜的内吞小泡上或在质膜上、细胞质基质中、高尔基体甚至是细胞核中找到，但很少在内质网或线粒体[9-11]中找到。特定的包裹在外泌体上的膜蛋白包括GPI-锚定蛋白、四跨膜蛋白家族和受体[如肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）]；其他包裹在外泌体内的特定分子类型包括：（1）腔蛋白；（2）抗原呈递物（MHC-I、MHC-II）和细胞黏附物、细胞结构和能动类（肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白等）；（3）热休克蛋白和分子伴侣；（4）代谢酶（β-烯醇酶、脂肪酸合酶等）；（5）信号蛋白[激酶、14-3-3蛋白、GTPase Hras、RhoA、RAP1B、鸟嘌呤核苷酸亚级结合蛋白（G蛋白）等]；（6）参与转录和蛋白质合成的蛋白（转录因子、核糖体蛋白、泛素等）。

2 外泌体与冠心病

在发现外泌体早期，研究多聚焦于外泌体在肿瘤中发生发展机制中的重要作用，随着对外泌体研究的不断深入，目前已证实外泌体介导的细胞间信息交流过程也广泛涉及心血管系统的生理及病理过程，有潜在的治疗心血管疾病的作用。

2.1 祖细胞 目前公认心脏祖细胞能在体外通过鼠类心肌活组织样本无性繁殖形成“球形”结构，并在鼠类或人活体组织切片可见类似“球形”物质[12]，该物质后来被认为是心球样细胞团（cardiac progenitor cells，CSs）。由于CSs含有心脏中存在的3种主要细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞）中的2种的祖细胞和定向祖细胞，因此为心脏再生提供了很好的细胞来源。最近，Ibrahim等[13]展示，心球样细胞团生成细胞（cardiospherederived cells，CDCs）生成的外泌体能复制CDC所诱导的治疗效果，并阻碍外泌体产生，抵消CDCs对小鼠心脏梗死产生的有益效应。其进一步研究了在CDC外泌体中尤其富含的miR-146a，有趣的是，miR-146a虽然可能是CDC外泌体起保护作用的主要原因，但是不足以单独产生综合的治疗效果。因此，其中其他miRNAs（如miR-22、miR-24）可能也发挥了同样的作用，或与miR-146a发挥综合效果。综上所述，Ibrahim等[13]提供的数据表明，CDC外泌体含有丰富的信号信息，尤其是通过这些外泌体转运的miRNAs能够在鼠类心肌梗死（AMI）模型中提供再生功能，并可不用通过移植活细胞即可提供CDCs同样的益处。另外，心脏祖细胞（cardiac progenitor cells，CPCs）也能向其周围环境释放外泌体，这些外泌体包含基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和细胞外基质金属蛋白酶诱导物（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），可对细胞外基质分解时提供援助并激活MMPs[14]。事实上，Vrijsen等[14]发现，在体外划痕实验中，CPC生成的外泌体能够刺激内皮细胞的迁移。Chen等[15]发现，与PBS对照组相比，在小鼠急性心肌缺血/再灌注（I/R）模型的小鼠体内递送CPC外泌体能抑制大约53%的心肌细胞凋亡。上述研究提示，外泌体是CPC介导的旁分泌效应中重要的心脏保护组分。

2.2 干细胞 目前对外泌体的研究主要集中在干细胞领域，最近的研究表明，干细胞修复心脏组织的有益效果是通过释放旁分泌和自分泌因子而发挥的[16]。实际上，干细胞能分泌多种类型的因子/分子以抑制局部免疫及炎性反应，促进血管生成、细胞分化及有丝分裂抑制纤维化和凋亡，对缺血心肌有保护和修复作用，这些因子/分子包括蛋白质、miRNAs、生长因子、抗氧化物、蛋白酶体、微囊泡和外泌体。其中，外泌体在基于脱细胞的干细胞治疗心血管疾病方面获得特殊关注。

Lai等[17]首次展示了人类胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）产生的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可分泌50～100 nm的膜泡。通过使用一种I/R损伤的离体Langendorff模型，观察到这些纯化的外泌体能够减少小鼠心脏的梗死面积。Arslan等[18]进一步证明，在再灌注前5 min单次快速静脉注射外泌体，可减少小鼠心脏梗死面积的45%。重要的是，其发现外泌体疗法可在I/R后30 min内修复小鼠心脏功能耗竭并恢复氧化还原状态，升高的ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）水平及氧化应激的降低可证明这一点。另外，活性CD73（负责通过释放腺嘌呤核苷酸来形成细胞外腺苷酸的主要酶类）和磷酸化PFKFB3（可上调磷酸果糖激酶）也包含在MSCs生成的外泌体中[18]。而且外泌体疗法能够减少小鼠心肌I/R后产生的系统性炎症[18]。因此，MSCs生成的外泌体在治疗急性心肌梗死方面有强大的潜力。同时，Lee等[19]报道小鼠骨髓分化的MSCs的抗炎活性与外泌体有关。通过采用一个缺氧诱导的肺动脉高血压（HPH）小鼠动物模型的研究证明，MCS生成的外泌体（MEX）在体内的传递可抑制HPH和血管重构。此外，高增殖信号也可被MEX治疗所阻断，证据有其可抑制转录-3（STAT3）磷酸化作用的信号传感器和活化剂，导致肺部miR-204（一种富含于肺动脉末端的微小RNA，可下调人类和疾病实验模型的pH值）水平的升高。Lee等[19]提供的数据显示，外泌体是MSC旁分泌功能的关键效应器。但是，其研究没有指明这些外泌体内所包含的关键成分。

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）也能产生外泌体，从而对心肌起到保护作用。最近，Sahoo等[20]的一项研究显示，人类CD34+干细胞具有分泌杯状外泌体的能力，其可表达CD63、磷脂酰丝氨酸和TSG101。体外研究发现，CD34+外泌体通过增强内皮细胞活力、增殖和在基底膜基质上的管状形成，复制了CD34+细胞生成血管的活性。在一些体内研究中，观察到CD34+细胞和CD34+外泌体均可诱导血管样内皮结构的生成。在角膜血管生成试验中，含有CD34+外泌体但不含CD34-外泌体的颗粒与血管生长大大增强相关。因此，这些发现预示着CD34+外泌体是CD34+细胞诱导血管生长的关键旁分泌组成。但是，CD34+外泌体介导的血管生成机制并不清楚，可能是由于外泌体受体诱导血管生成信号流的激活，或是外泌体内容物（蛋白质/RNAs）整体转移至内皮细胞的细胞质中。事实上，Sahoo等[20]提供的数据证明，与CD34-外泌体相比，CD34+外泌体高度富含促血管生成的miR-126和miR-130a。但是，这些外泌体miRNAs的转移程度及诱导接受细胞内的何种分子改变仍有待明确。

另外，值得注意的是，缺血预调（ischemic preconditioning，IPC）可对心脏I/R所诱导的损伤产生强大的保护作用[21-22]。但其机制仍不完全清楚。最近，Giricz等[23]表示，通过蛋白质免疫印迹试验提示，从IPC大鼠心脏收集的冠状动脉流出物比对照组包含更多的细胞外囊泡（EVs、微囊泡和外泌体）。此外，发现用从IPC大鼠心脏收集的冠状动脉流出物灌注后，心脏梗死面积与对照组相比明显更小。有趣的是，用EVs耗尽的IPC冠状动脉流出物灌注，则梗死面积与对照组相似。因此，其研究表明，从IPC心脏中释放的微囊泡/外泌体是造成心脏内保护信号传递的原因[23]。与之类似的，Jeanneteau等[24]最近发现，在经历后肢I/R的动物血液中生成的微囊泡不能降低大鼠心肌梗死面积。上述研究表明，不是微囊泡（微粒），而是外泌体在传播心脏保护信号中发挥作用。当然，需要采用临床相关的体内模型进一步研究阐明IPC-外泌体介导的心脏保护机制。

3 外泌体与心肌疾病

最近的几项研究表明，败血症患者血浆中外泌体的存在可能会造成血管和心脏的功能障碍。Gambin等[25]报道了在败血症中，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生和脂多糖（ipopolysaccharide，LPS）的存在能够触发血小板释放外泌体。通过蛋白质免疫印迹试验的证据，这些败血症的外泌体比正常的外泌体包含更高水平的还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）。重要的是，这些作者发现NO诱导的和人败血症血小板所产生的外泌体可诱导caspase-3活化，可通过NADPH氧化酶和Ⅱ型NOS产生活性氧/活性氮（reactive oxygen species/reactive nitrogen specie，ROS/ RNS），使靶向内皮细胞凋亡。提示在病理条件下，血小板产生的外泌体可致血管损伤。Azevedo等[26]进一步提供证据表明，败血症患者循环中血小板所产生的外泌体可诱导离体的兔心脏心肌收缩力降低和大鼠乳头状肌准备减少。这些外泌体的危害可通过预暴露于LPS而增强，证实败血症血小板所产生的外泌体可保护NOS，在外泌体内生成NO并诱导心脏内产生NO。在糖尿病性心肌病变中，心肌血管再生不足是糖尿病导致的缺血性心血管疾病的主要表现形式[27]。在哺乳类动物心脏中，通常认为内皮细胞在心肌细胞存活和心肌收缩中起关键作用。然而，当应对应激状态（如高血糖症）时，心肌细胞是否有能力影响内皮细胞功能仍是普遍未知的。Wang等[28]报道，与单独培养相比，当心脏内皮细胞（endothelial cells，ECs）与患有2型糖尿病大鼠（GK）的心肌细胞共培养时，ECs的增殖和迁移受到显著抑制。与之相比，ECs与从健康大鼠体内分离的心肌细胞共培养，则可促进 ECs的增殖和迁移[28]。因此，这些数据表明，正常状态下心肌细胞可能对ECs是有益的，而糖尿病型的肌细胞可能损害ECs的功能。无论心肌细胞对ECs有益还是有害，当使用外泌体抑制剂GW4869处理后，ECs均会被除去。该团队的进一步研究揭示，与从正常心肌细胞中收集的外泌体相比，糖尿病GK心肌细胞中的外泌体含有更高水平的miR-320和更低水平的miR-126和热休克蛋白20（heat shockprotein 20，Hsp20）蛋白，重要的是，心肌细胞外泌体miR-320可被转运至内皮细胞，从而下调胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）、Hsp20和外转录间隔区-2（external transcribed spacer-2，Ets-2）的表达，导致EC增殖、迁移和管腔形成受抑制[28]。因此，上述研究可提供一种新的机制解释糖尿病中心肌血管生成的受损可能是由于心肌细胞分泌抗血管生成外泌体所致。

4 小 结

外泌体作为一种治疗性载体，目前的研究主要集中在肿瘤领域，在心血管领域的研究多为现象描述，仍处于起步阶段。外泌体是一种新型生物学标志物，作为干细胞移植疗法中的关键载体，为研究和完善心脏保护性治疗靶点提供了新思路。因此，对外泌体的进一步研究，将更系统和准确地了解其与心脏细胞之间的信号机制、疾病的转归过程，对优化心脏疾病的诊治、预防具有重要的临床意义。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.019

A

1009-5519（2015）16-2461-04

2015-03-26）

陈家显（1988-），男，海南昌江人，硕士研究生，主要从事心血管疾病临床诊断与治疗工作；E-mail：564455650@qq.com。

桂庆军（E-mail：1113889115@qq.com）。