番茄早疫病菌拮抗细菌的筛选及其抑制作用

孙广正，侯 栋,岳宏忠,赵桂琴,姚 拓,柴晓虹,陈 龙

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院蔬菜研究所,甘肃 兰州 730070)

番茄早疫病菌拮抗细菌的筛选及其抑制作用

孙广正1，侯 栋2,岳宏忠2,赵桂琴1,姚 拓1,柴晓虹1,陈 龙1

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院蔬菜研究所,甘肃 兰州 730070)

为了筛选对番茄早疫病菌具有生防作用的菌株，利用前期研究获得的17株促生菌，采用平板对峙法测定其对病原真菌的拮抗作用及对菌丝生长的抑制作用。结果发现,可有效拮抗番茄早疫病菌的生防菌有2株，其中，菌株FX2的抑菌活性较好，抑制率达到70.52%，菌株LHS11的抑制率为65.34%。菌株FX2和LHS11可通过次生代谢物抑制病原真菌，其中菌株LHS11的发酵液对番茄早疫病菌的抑制率达到65.40%，菌株FX2的发酵液的抑制率为47.26%。菌株FX2和LHS11能使病原菌菌丝发生不同程度扭曲变形。

番茄早疫病；PGPR菌；生物防治；作用机理

番茄早疫病又称轮纹病，由茄链格孢菌(Alternariasolani)引起，造成番茄叶斑、果腐和茎病变[1]。这种真菌病害常大面积发生，造成番茄大量减产，严重威胁番茄生产。尤其20世纪70年代后期以来，我国部分地区由于推广的番茄品种抗病毒病而不抗早疫病，导致早疫病的大面积发生，危害日趋严重。一般年份发病率在10%，造成产量损失10%～30%；流行年份发病率可达100%，产量损失达30%～40%[2]。目前，该病害仍主要依靠化学农药防治，但化学农药的长期使用，容易造成病原菌抗药性增强。农业可持续发展要求植物病虫害的防治应逐步降低化学农药的用量，大力研发高效低毒且环境兼容性好的植保替代产品。

生物农药具有低残留、不易产生抗药性、源于生物、对环境友好等诸多优点，已被越来越多的人们所接受，并且成为病害防治的一个重要途径[3]。其中，利用细菌特别是植物根际促生细菌(PGPR)防治植物病害成为生物防治的重要研究领域。邢袆博[4]从番茄根际土壤中分离到菌株7-19，该菌对番茄早疫病菌株的生长具有很强的抑制作用，抑菌圈直径为24 mm，并且菌株发酵液对另外7种病原菌也具有较高的拮抗活性。王宇婷等[5]研究发现，短短芽孢杆菌011菌发酵滤液对8种植物病原真菌均有抑制作用，其中对番茄早疫病菌抑制作用较强，抑菌带宽为5.5 mm，并且对番茄早疫病菌菌丝和孢子均有致畸作用。PGPR能通过产生抵抗多种病原菌的抗生素类物质、毒素或诱导寄主植物产生病程相关蛋白等途径，帮助植物抵抗生物类侵害。因此，筛选高效广适的PGPR菌成为研发生物制剂的先决条件。以前期工作获得的17株菌为原始材料，用平板对峙生长法研究植物根际促生菌对番茄早疫病菌的防治作用，以期为该真菌引起的植物病害的生物防治提供新的菌种资源和科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

PGPR菌：Jm170、Jm92、LX191、G、Jx59、Lx22、Lx81、LHS11、LM4-3、4N4、XX1、XX2、XX5、XX6、FX1、FX2和F1-4，分离自小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、苜蓿(Medicagosativa)和三叶草(Trifoliumpratense)等植物根际，具有良好的固氮、溶磷及分泌植物激素特性(表1)，由甘肃农业大学草业学院草地微生物实验室提供。

表1 供试菌株Table1 Tested strains

注:“*”待鉴定,“-”表示促生特性微弱，其余菌株促生特性尚未发表

供试植物病原真菌：番茄早疫病菌由甘肃农业大学草业学院提供。

培养基：PDA培养基用于真菌培养和平板对峙培养[12]，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18～20 g，加水至1 L。

LB固体培养基用于分离和保存根际细菌[13]：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，pH 7.0～7.2，加水至1 L。LB液体培养基用于发酵根际细菌。

1.2 方法

1.2.1 优良生防菌初筛 按荣良燕的方法[12]，采用平板对峙法测定所有的供试菌株对番茄早疫病菌的拮抗作用。将保存在PDA斜面上的番茄早疫病菌接种到PDA平板上，25 ℃培养5～7 d。供试PGPR菌接种在LB液体培养基中，150 r/min，培养24 h，细菌菌液浓度106μg/mL备用。再将病原菌与细菌同时接种在PDA平板上，平板中心接种真菌，菌饼的直径为6 mm，距中心1.7 cm处等距离接种4种不同的细菌(用加液枪将菌液垂直滴在培养基上)，每种组合3个重复。25 ℃培养，根据真菌的生长情况在适宜天数测量真菌距细菌近端的半径。

抑菌率= [ (对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%

1.2.2 优良生防菌复筛 挑选抑菌圈较大，被抑制病菌边缘平齐且拮抗作用持久的生防菌进行复筛。方法同1.2.1。距平板中心1.7 cm处4点接种同一种细菌，每种组合3个重复。

1.2.3 生防菌发酵液的抑菌作用 发酵液的制备：按文献[14]的方法，将活化好的优良生防菌单菌落，接种至含100 mL的LB液体培养基摇瓶中，于28 ℃，150 r/min摇床培养24 h，移至150 mL离心管中，12 000 r/min离心20 min，先用无菌滤纸过滤，再用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌得无菌发酵液。将收集的发酵液存放至4 ℃冰箱备用。

在无菌条件下，将无菌发酵液与冷却至45 ℃的PDA培养基按1∶9的比例混匀，并制成含无菌发酵液的平板培养基，以不含发酵液(加同样比例的无菌水)PDA平板为空白对照。每个处理设3个重复，试验重复2次。在平板中央放入直径6 mm的病原菌菌饼，25 ℃恒温培养，从第3 d开始观察生长情况，在对照菌落长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，得到生防效果最好的菌株。

1.2.4 生防菌对病原菌菌丝生长的影响 在显微镜(10×40)下观察靠近生防菌的抑菌圈边缘菌丝生长情况，以正常生长的病原菌边缘菌丝为对照，在显微镜下观察生防菌对病原菌菌丝形态的影响。

1.2.5 优良生防菌株拮抗反应测试 按文献[15]的方法，采用牛津杯法测试优良生防菌株间的拮抗反应。将一种菌在液体培养基中培养24 h的菌悬液，以2%(v/v)的量接种到发酵培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h；发酵液8 000 r/min离心10 min，上清过0.22 μm滤膜，取滤液100 μL滴加在含有2%另一种细菌的LB平板中央的牛津杯中(直径7 mm)，待发酵滤液扩散后置28 ℃条件下恒温培养。以无菌水作阴性对照。将供试细菌两两进行抑菌试验，每个处理3次重复，1 d后观察抑菌圈的有无，若有抑菌圈，说明两细菌间有拮抗作用，若无抑菌圈，且细菌生长良好，则说明这两个细菌可以共存，各菌株间没有拮抗作用。

1.2.6 数据分析 采用SPSS 16.0软件中的Duncan氏新复极差法对所有数据进行单因素分析。

2 结果与分析

2.1 筛选拮抗番茄早疫病菌的优良生防菌

在供试生防菌中，有效拮抗番茄早疫病菌的有2株，抑制率大于60%(表2)。在培养3 d后，除了菌株Jm92和4N4，其他菌株均表现出一定的抑制作用，抑制率大于30%的菌株有7株，其中，菌株FX2的抑菌活性较好，抑制率达到43.80%，和其他菌株相比差异显著。随着培养天数的增加，8株生防菌的抑制率有所提高，其余菌株失去抑菌活性。培养7 d，菌株LHS11和FX2能明显抑制病原菌菌丝的生长(图1-A2，A3)，抑制率均大于60%。其中，FX2的抑菌能力较强，抑制率达到70.52%，与LHS11差异不显著，和其他菌株相比差异显著。培养9 d后，在半径为45 mm的平板上长满对照菌落(图1-A1)。

表2 生防菌对番茄早疫病菌的拮抗作用Table2 Inhibition of bio-control strains against Alternaria solani

注:“-”表示无抑制作用，表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)

2.2 生防菌发酵液与番茄早疫病菌拮抗

供试生防菌在培养3 d以后，LHS11和FX2的发酵液对番茄早疫病菌均有抑制作用，抑制率分别为52.07%和33.06%(表3)。随着天数的增加，发酵液对病原菌的抑制率提高。培养7 d，LHS11和FX2的发酵液表现出明显的抑制作用(图1-B2，B3)，其中，LHS11的发酵液的抑菌能力较强，抑制率达到65.40%，FX2为47.26%。

表3 生防菌与番茄早疫病菌拮抗及抑制率Table3 Antagonism and inhibition rate of fermentation solution of bio-control strains against Alternaria solani

图1 生防菌与番茄早疫病菌平板对峙Fig.1 The panel confrontation of bio-control strains and Alternaria solani

注：A.活菌;B.发酵液;C.菌丝光镜照片;1.对照;2.生防菌LHS11;3.生防菌FX2；C.为光镜照片,放大倍数为10×40；C1.正常菌丝；C2.菌丝膨大；分枝增多C3.菌丝弯曲、肿胀,细胞质外渗

2.3 生防菌对番茄早疫病菌菌丝生长抑制作用

挑取经生防菌抑制的番茄早疫病菌菌丝在显微镜下观察，生防菌LHS11使菌丝膨大变粗(图1-C3)。菌株FX2使菌丝中膨大出球形节点，有的细胞中看不到细胞质，仅剩细胞壁(图1-C2)。对照番茄早疫病菌菌丝呈均匀丝状，纤细，表面光滑(图1-C1)。

2.4 菌株拮抗反应测试

在1 d后观察发现无抑菌圈，且细菌生长良好，说明优良生防菌LHS11和FX2之间可以共存，没有拮抗作用。

3 讨论

随着人们对环境和食品安全要求的提高，对植物病害防治提出了新的要求，研制开发无污染、低残留、环境和谐型的生物农药已经成为农药发展新的热点。李振东等[16]研究发现，莫海威芽孢杆菌Z17对8种病害的抑菌带宽均>5 mm，其中，对番茄早疫病菌的抑菌带宽达到8 mm。何建清等[17]研究发现放线菌10-4对番茄早疫病菌的抑制率达到93.1%，其发酵原液和5倍稀释液在活体植株上对番茄早疫病的防治效果分别达到77.2%和70.9%，并且对小麦根腐病菌、稻瘟病菌、立枯丝核菌、小麦全蚀病菌、苹果炭疽病菌和玉米大斑病菌的生长抑制率均达到90%以上。试验筛选得到生防活性较好的菌株LHS11和FX2，其中，FX2的抑菌活性较好，抑制率为70.52%。2株生防菌的发酵液对病原菌均表现出抑菌能力，其中，菌株LHS11的抑制率为65.40%。前期工作还发现菌株LHS11和FX2对尖孢镰刀菌、油菜菌核病菌、小麦长蠕孢、黄瓜枯萎病和立枯丝核菌也有很好的抑菌活性。因此，菌株LHS11和FX2具有良好的应用潜力和前景。

生防菌防治植物病害的作用机制主要有营养和空间位点的竞争、分泌抗菌物质、寄生和诱导植物体抗性。任璐等[18]研究发现，植物内生细菌yc8发酵液对番茄早疫病菌孢子萌发有较强的抑制作用，发酵液处理后可造成病原菌细胞畸形，胞内物质外泄和细胞壁崩溃。马桂珍等[19]研究发现，多粘类芽孢杆菌L1-9菌株的发酵液和无菌发酵液能明显降低番茄早疫病菌的孢子萌发率并抑制芽管的伸长，并且发酵液的抑制作用高于无菌发酵液。试验发现生防菌LHS11使番茄早疫病菌菌丝膨大变粗，菌株FX2使病原菌菌丝中膨大出球形节点，有的细胞中看不到细胞质，仅剩细胞壁。本研究主要从对病原菌菌丝形态的影响及其分泌抗菌物质的角度对生防菌抑菌机理进行初步探索，对菌株后续的研究有一定的参考价值。至于其是否还存在其他的作用机制还有待于进一步的研究探索。

为了进一步明确PGPR菌对番茄早疫病菌的防效以及对植株的促生作用，还可通过盆栽试验和大田试验测定优良生防菌的防病能力。梁建根等[20]筛选得到生防能力较好的菌株，在盆栽试验中研究发现，PGPR菌均能促进植物的生长，也能防止病害的发生。李志新等[21]用两种PGPR菌剂不同接种剂型处理油菜，发现PGPR菌剂能明显增加油菜的单株有效角果数，还能降低油菜菌核病的发病率。一些学者发现施用PGPR菌肥也可促进农作物根长、根系干重及根体积等根系性状的改善[22，23]。大多数的研究表明，混配制剂提高了生物防治的效果，但前提是拮抗同一病原菌的生防菌组合间表现为亲和性。试验中筛选得到的优良生防菌LHS11和FX2之间无拮抗反应，在后续工作中可通过混配防治病害，为盆栽试验和大田试验奠定基础。

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Screening of bacteria antagonizingAlternariasolaniand its inhibitory effects

SUN Guang-zheng1，HOU Dong2，YUE Hong-zhong2，ZHAO Gui-qin1，YAO Tuo1，CHAI Xiao-hong1，CHEN Long1

(1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Lanzhou730070,China)

Seventeen strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) acquired from the preliminary studies were used to study their antagonistic effects on pathogenic fungi and the inhibition of mycelial growth in order to obtain biocontrol agents for promoting plant growth and also preventAlternariasolani,and to clarify the inhibitory efficiency of agents by panel confrontation method.The results showed that two strains efficiently antagonizedAlternariasolani,the inhibition rate of strain FX2 was higher which could reach 70.52% and LHS11 65.34%.FX2 and LHS11 could prevent disease by secondary metabolites,the inhibition rate of the fermentation solution of LHS11 reached 65.40%.The strains FX2 and LHS11 could make the mycelial twist and deformation at different degrees.

Alternariasolani；plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)；biocontrol；mechanism

2014-08-21；

2014-10-14

公益性行业(农业)科研专项经费(201303112)和现代农业产业技术体系(CARS-08-C)资助

孙广正 (1988-)，男，甘肃庆阳人，在读硕士研究生。 E-mail：sunfanfan885@163.com 姚拓为通讯作者。

S 431

A

1009-5500(2015)01-0032-06