白介素8蛋白表达水平及基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺的相关性

王文艺，丁 巍，杨晓红



·论著·

白介素8蛋白表达水平及基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺的相关性

王文艺，丁 巍，杨晓红

目的 探讨血清及肺泡灌洗液(BALF)中白介素8(IL-8)蛋白表达水平，及血清中单核苷酸多态性与新疆维吾尔族饲鸽者肺(PBL)遗传易患性的相关性。方法 选取2012—2013年在新疆喀什地区有鸽子接触史，且血清学抗体阳性，符合PBL诊断标准的维吾尔族患者32例(病例组)；选取有鸽子接触史，但血清学抗体阴性者30例(阴性对照组)；选取无鸽子接触史且健康维吾尔族者30例(正常对照组)。采用ELISA分别检测3组受试者血清及BALF中IL-8蛋白表达水平；通过UCSC数据库选取IL-8的15个基因位点，采用Sequenom MassARRAY®SNP分型技术对所有位点进行基因分型，比较3组IL-8基因型分布。结果 3组血清、BALF中IL-8蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组和病例组血清、BALF中IL-8蛋白表达水平均高于正常对照组，病例组血清中IL-8蛋白表达水平高于阴性对照组(P<0.05)。选取的15个基因位点的IL-8基因型分布在3组间不存在基因多态性。结论 血清、BALF中IL-8蛋白表达水平的增高可能是肺损伤及肺纤维化的诱因，其基因多态性不增加维吾尔族PBL的发病风险。

养鸟者肺；肺泡炎，外源性变应性；白细胞介素8；多态性，单核苷酸

王文艺，丁巍，杨晓红.白介素8蛋白表达水平及基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺的相关性[J].中国全科医学，2015，18(26)：3173-3176.[www.chinagp.net]

Wang WY，Ding W，Yang XH.Correlation between cytokines IL-8 expression，its gene polymorphism and pigeon breeder′s lung in Uygurs[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3173-3176.

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012—2013年在新疆喀什地区有鸽子接触史，且血清学抗体阳性，符合Lacasse等[5]提出的HP诊断标准的维吾尔族患者32例(病例组)，其中男23例，女9例；平均年龄(53.3±12.4)岁；平均接触鸽子(19.5±11.3)年。选取有鸽子接触史，但血清学抗体阴性者30例(阴性对照组)，其中男27例，女3例；平均年龄(53.3±14.2)岁；平均接触鸽子(21.6±14.3)年。病例组与阴性对照组均无自身免疫系统疾病、胶原病、糖尿病及其他肺部疾病。另选取同期无鸽子接触史且健康维吾尔族人群30例(正常对照组)，其中男16例，女14例；平均年龄(53.1±11.0)岁。3组之间性别和年龄比较，差异均无统计学意义(χ2=4.796，P=0.091；F=0.005，P=0.364)。受试者均签署知情同意书。

1.2 资料收集 受试者均接受问卷调查，内容包括：个人一般情况(性别、年龄、种族、吸烟史)、鸽子接触史(接触时间、饲养种类、数量)、PBL诊断史、既往病史和家族史。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA制备 所有入选者于清晨空腹抽取静脉血4 ml，以3.2%枸橼酸钠抗凝，以3 000 r/min离心5 min，留取上清液置于-80 ℃冰箱内储存备用。按照全血基因组DNA试剂盒说明书提取DNA，采用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20 kb，将质检合格的DNA浓度调整到50 mg/L，转移至384孔板，-20 ℃储存备用(见图1)。

图1 DNA提取图

1.3.2 ELISA法检测细胞因子表达水平 入选者均行气管镜检查，留取肺泡灌洗液(BALF)150 ml，采用单层纱布过滤，除去黏液，将滤液在4 ℃条件下，以1 200 r/min离心10 min后，分离上清液装入硅塑瓶，-80 ℃储存备用。采用ELISA法检测受试者血清、BALF中IL-8蛋白表达水平，严格按照试剂盒说明书操作，在96孔的平板中加入100 μl稀释的包被抗体，4 ℃孵育过夜，经清洗、封闭后，在各孔中加入100 μl稀释液〔0.1%牛血清清蛋白(BSA)100 mg加入100 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中〕，在室温下孵育60 min，每孔加入100 μl稀释的生物素化的小鼠抗细胞因子抗体，在室温下孵育60 min后，再加入100 μl按照1∶1 000稀释的结合辣根过氧化物酶的亲和素稀释液，在室温下孵育30 min，最后在每个孔中加入100 μl底物溶液，黑暗中室温孵育30 min，再加入12.5% H2SO4终止反应，将标准品的测试结果绘制成标准曲线，在分光光度计490 nm波长下读取光密度值，重复测量3次，根据测定结果计算细胞因子的表达水平。

1.3.3 设计引物 在UCSC数据中通过盲筛的方法选取IL-8的15个位于启动区的基因位点，采用Sequenom MassARRAY Assay Design(美国Sequenom公司)进行引物设计，北京博奥生物有限公司负责引物合成(见表1)。

表1 IL-8基因SNP位点的PCR引物及单碱基延伸引物序列

Table 1 PCR primers and single base extension primer sequences of IL-8 gene SNP locus

SNP位点PCR引物序列(5'-3')单碱基延伸引物序列(5'-3')rs139503118正向:ACGTTGGATGCCACTCTCAATCACTCTCAGCATACTCCAAACCTTTCC反向:ACGTTGGATGGCCAAGGAGTGCTAAAGAACrs142957504正向:ACGTTGGATGCCACCTTCCTTAATTTTAAGTttACCACACTGCGCCAACA反向:ACGTTGGATGATTGAGAGTGGACCACACTGrs144469788正向:ACGTTGGATGCCACTCTCAATCACTCTCAGGATGTCAGTGCATAAAGACATAC反向:ACGTTGGATGGCCAAGGAGTGCTAAAGAACrs149273289正向:ACGTTGGATGGGAAAGGTTTGGAGTATGTCaaagtAGTGCTAAAGAACTTAGATGT反向:ACGTTGGATGTGCAGTTTTGCCAAGGAGTGrs185040023正向:ACGTTGGATGGGCTGACTTTGGATTATATGaGGTTGTGGAGAAGTTTTTGA反向:ACGTTGGATGTGCAGAGGGTTGTGGAGAAGrs200005090正向:ACGTTGGATGCCTTCTTATTAAACATAGCTCAGAATGAATTTTTTTATGAATTCTCA反向:ACGTTGGATGCACTGATTCTTGGATACCACrs200094083正向:ACGTTGGATGTGTCCTAGAAGCTTGTGTGCtGTGATGATATAAAAAGCCACC反向:ACGTTGGATGAGTTCTCTAGTAGGGTGATGrs200141723正向:ACGTTGGATGAAGAGCCAGGAAGAAACCACCCAGCTTGGAAGTCATG反向:ACGTTGGATGAAATCAGGAAGGCTGCCAAGrs200170390正向:ACGTTGGATGTGGGCCATCAGTTGCAAATCcTATCATCACCCTACTAGAGAACTTA反向:ACGTTGGATGCTCCGGTGGCTTTTTATATrs200662278正向:ACGTTGGATGCTTTGGATTATATGTCTCAGGGGGTTGTGGAGAAGTTTT反向:ACGTTGGATGAAACTGGGTGCAGAGGGTTGrs201217708正向:ACGTTGGATGTTTACACACAGTGAGATGGgAGGACAAGAGCCAGGAAGAAACCAC反向:ACGTTGGATGAGCACACAAGCTTCTAGGACrs202202182正向:ACGTTGGATGAGAGCCAGGAAGAAACCACCaagAGGAAGGCTGCCAAGAGA反向:ACGTTGGATGCTGCAGAAATCAGGAAGGCrs3181685正向:ACGTTGGATGGTATTATTTATTTGAATCTACGCAATATCTAGGAAAATCCTTATATT反向:ACGTTGGATGGTGCAATATCTAGGAAAATCrs373821605正向:ACGTTGGATGATAATTTCTGTGTTGGCGGAGAGTGATTGAGAGTGGA反向:ACGTTGGATGTACTCCAAACCTTTCCACCCrs56002960正向:ACGTTGGATGAAGAGCCAGGAAGAAACCACTACACACAGTGAGATGG反向:ACGTTGGATGAAATCAGGAAGGCTGCCAAG

1.3.4 基因分型分析 利用Sequenom MassARRAY®SNP分型技术对IL-8的15个位点进行基因分型。步骤如下：(1)扩增目的基因片段：将适量基因组DNA按一定顺序分别加至384孔板，再添加PCR扩增体系使反应物的终浓度如下：Taq聚合酶0.1 U，基因组DNA 5 ng，PCR引物各2.5 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L。PCR反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环45次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持；(2)SAP反应：添加0.3 U碱性磷酸酶去除剩余的dNTP。条件为：37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min；4 ℃维持。(3)单碱基延伸：添加5.4 pmol/L的延伸引物，50 Umol/L dNTP/ddNTP混合物，0.5 U Thermosequenase DNA聚合酶，反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s,循环40次，72 ℃ 3 min。(4)树脂纯化：反应产物平铺在6 mg树脂板上，加16 μl水到对应孔内，把干燥后的树脂倒入到延伸产物板上，封膜，低速垂直旋转30 min，使树脂与反应物充分接触，离心将树脂沉入孔的底部。(5)芯片点样及质谱检测：将纯化产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上后上机测定。SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用TYPER 4.0软件(Sequenom)分型，并输出结果。

2 结果

2.1 血清及BALF中IL-8蛋白表达水平比较 3组血清、BALF中IL-8蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组和病例组血清、BALF中IL-8蛋白表达水平均高于正常对照组，病例组血清中IL-8蛋白表达水平高于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2 Comparison of protein expression level of IL-8 in serum and BALF among the three groups

组别例数血清BALF正常对照组302.6±1.92.4±1.8阴性对照组3017.4±4.8a18.2±4.4a病例组3230.2±4.1ab27.2±4.6aF值11.8476.690P值0.0050.002

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05；BALF=肺泡灌洗液

2.2 IL-8的位点在不同组中分型结果 3组中IL-8 rs139503118、rs185040023、rs200141723、rs200170390、rs3181685、rs56002960基因位点均只存在AA基因型；rs142957504、rs149273289、rs200005090、rs201217708、rs202202182、rs373821605基因位点均只存在CC基因型；rs144469788、rs200662278基因位点均只存在TT基因型；rs200094083基因位点只存在GG基因型，故表明选取的15个基因位点的基因型分布在3组间不存在基因多态性。

3 讨论

近年来流行病学资料表明，HP是仅次于结节病和特发性肺纤维化(IPF)的一种常见肺间质性疾病。一项爱鸽俱乐部人员的调查显示，鸽子饲养者PBL患病率为8%～30%[6]，没有明显的季节性，在欧洲和美国多发生于男性，在墨西哥则多发生于女性，同时笔者在临床工作中发现维吾尔族PBL男性多于女性，可能与维吾尔族有饲养鸽子的习惯有关，尽管暴露于饲养鸽子环境的人数较多，但仅有5%～15%个体发病，说明与外源性抗原及自身遗传易患性相互作用有关[7]。PBL的病因及发病机制较为复杂，尚未完全明确。

EAA是由于反复吸入分散抗原或对分散抗原敏感而引起，临床表现为淋巴细胞/巨噬细胞激活形成的肺炎以及表皮细胞形成肉芽肿[8]。IL-8是CXC亚家族趋化性细胞因子的一种，含有4个半胱氨酸残基，并形成特征性的链内二硫键，对中性粒细胞具有强趋化作用并可使之激活进入肺泡，中性粒细胞在肺泡中的积累以及介导的损伤均会引起亚家族功能的异常和纤维化[9]。有研究表明，COPD患者的痰液、BALF中炎性细胞总数及IL-8高表达在COPD气道炎症的发生发展过程中发挥重要作用[10]；本研究结果显示：长期饲养鸽子者较未饲养鸽子维吾尔族者血清及BALF中IL-8蛋白表达水平较高，BALF中病例组与阴性对照组比较无差异，而血清中病例组高于阴性对照组。可能通过以下机制高表达：一方面可能通过趋化炎性细胞移向肺组织引起炎性反应，血清IL-8的水平增加与中性粒细胞性肺泡炎的程度有关，其表达水平的增高，可能是肺损伤和纤维化的诱因；另一方面研究发现血管生成(从已经存在的血管上生长出新的血管)是生理性和病理性组织损伤应答中的基本环节之一，IL-8是促进血管生成的趋化因子，根据环境的不同对机体产生有利或有害的效应，IL-8促进血管生成的作用影响了肺纤维化的进展[11]。最新研究亦发现，EAA患者血清、BALF中IL-8蛋白表达水平明显升高[12]，与本研究结果一致。

Hull等[13]提出IL-8基因启动子区域的某些位点的单核苷酸多态性与IL-8基因转录活性及血清IL-8蛋白表达水平有关，细胞因子蛋白表达水平与其基因多态性有关，不同的基因型有可能产生不同的蛋白或者改变其转录率，从而影响疾病的易感性及其严重性[14]。本研究数据证明了IL-8蛋白表达水平在饲养鸽子人群中会增高，本研究通过盲筛的方法选取位于启动区的15个基因位点进行基因多态性的分析，进一步探讨IL-8基因型分布在同种族人群中有无统计学差异。而结果显示：所选取的15个基因位点均不存在基因多态性。由此可以推断：IL-8蛋白表达可能在PBL的肺损害及肺纤维化形成中起作用，而其基因多态性不增加PBL的遗传风险。从遗传学的角度来看，查找与疾病发生相关的基因，主要通过SNP数据库入手查找基因位点进行多态性的分析，该方法虽简单易行，但可能得到阴性结果，存在一定的风险性。而本研究所纳入病例组的人群并未明确分急性期、亚急性期及慢性期，在UCSC数据中通过盲筛选择突变位点进行基因分型，存在一定的盲目性，且分析时仅在小样本中行初步尝试，尚需进一步加大样本量及增加基因位点进行重复研究来证实和阐明PBL的遗传学机制，为基因诊断、治疗提供新思路。

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(本文编辑：贾萌萌)

Correlation Between Cytokines IL-8 Expression，Its Gene Polymorphism and Pigeon Breeder′s Lung in Uygurs

WANGWen-yi，DINGWei，YANGXiao-hong.

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，People′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830000，China

Objective To investigate the correlation between the protein expression level of IL-8 in serum and BALF，single nucleotide polymorphism in serum and the genetic susceptibility to pigeon breeder′s lung(PBL) in Uygurs.Methods From 2012 to 2013，we enrolled 32 subjects Uygurs who had contact with pigeons，had positive serologic antibody and accorded with diagnostic criteria as case group；we enrolled 30 people who had contact with pigeons and were with negative serological antibody as negative control group；we selected 30 healthy uygurs who had no contact with pigeon as normal control group.The subjects were all selected from Kashi Prefecture.ELISA was used to detect the protein expression level of IL-8 in serum and BALF of the subjects.Through UCSC database，we selected 15 genetic loci of IL-8.Sequenom MassARRAY®SNP typing technology was employed to conduct genetic typing.Comparison was made among the three groups in the genotype distribution of IL-8.Results The three groups were significantly different(P<0.05)in the protein expression level of IL-8 in serum and BALF；the negative control group and the case group were higher(P<0.05)than the normal control group in the protein expression level of IL-8 in serum and BALF，and the case group was higher(P<0.05)than the negative control group in the protein expression level of IL-8 in serum.No gene polymorphism was found in the 15 gene loci of IL-8 of the three groups.Conclusion The increase of protein expression level of IL-8 in serum and BALF may be an incentive to cause lung injury and fibrosis，but gene polymorphism does not increase the risk of PBL in Uygurs.

Bird fancier′s lung;Alveolitis，extrinsic allergic；Interleukin-8；Polymorphisms，single nucleotide

国家自然科学基金资助项目(81260003)

830000新疆乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科

杨晓红，830000新疆乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科；E-mail：yxh6176@126.com

R 563.19

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.012

2015-01-06；

2015-06-06)