基于吲哚-3-甘油磷酸合成酶结构的新型抗结核药物的筛选

周涛, 王菲菲，黄强，王洪海，沈洪波

1. 上海大学生命科学学院，上海 200444； 2. 中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031； 3. 复旦大学基础医学院病原生物学系，上海 200032； 4. 复旦大学生命科学学院，上海 200433



基于吲哚-3-甘油磷酸合成酶结构的新型抗结核药物的筛选

周涛1,2, 王菲菲3，黄强4，王洪海4，沈洪波2

1. 上海大学生命科学学院，上海 200444； 2. 中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031； 3. 复旦大学基础医学院病原生物学系，上海 200032； 4. 复旦大学生命科学学院，上海 200433

摘要：本研究通过同源建模方法，模拟结核分枝杆菌H37Rv来源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)的结构，采用分子对接法，以IGPS结构为基础，从包含60 000种化合物的Maybridge化合物库中筛选出能与IGPS活性中心良好结合的化合物，并用抑菌实验等生物学方法进行验证。结果表明，化合物ATB26能与IGPS很好结合，且能体外有效抑制H37Rv和临床分离的敏感和耐药菌株的生长，其对结核分枝杆菌的体外最低抑菌浓度约为0.1 μg/ml。细胞毒性实验表明，ATB26与临床常用抗结核药物异烟肼、乙胺丁醇类似，对THP-1细胞系毒性较小。结果提示，化合物ATB26是一个新型IGPS抑制剂，有望开发成为新型的抗结核药，也可作为新型抗结核药物开发的一个潜在靶点。

关键词：吲哚-3-甘油磷酸合成酶；结核分枝杆菌；抑制剂

耐药结核病的出现是近年来结核病肆虐的主要原因之一，人们急需开发新型抗结核药物。基于药物作用靶蛋白的药物筛选和设计，是近年来发展的新型药物开发技术。本研究基于结核分枝杆菌来源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerol phosphate synthase，IGPS)结构，进行新型抗结核药物的筛选。

IGPS是催化生物体内色氨酸生物合成的重要酶，将底物烯醇式1-(O-羧基苯氨基)-1-脱氧核酮糖-5′-磷酸(CdRP)催化，生成吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glycerol phosphate, IGP)[1-3]。IGPS与结核分枝杆菌细胞壁合成及菌体内脂质代谢关系密切，对维持结核分枝杆菌的存活起重要作用[4]。Himarl转座子突变实验也证明，IGPS的编码基因TrpC是结核分枝杆菌的必需基因[5]。因为哺乳动物和人体中均不存在IGPS，所以IGPS可作为抗结核药物的候选靶位，基于其开发的靶向性新型抗结核药对人体的毒副作用将较小。

本研究首先通过同源建模方法获得结核分枝杆菌来源的IGPS三维结构；然后对IGPS结构进行优化，利用AutoDock程序从Maybridge化合物数据库中通过分子对接筛选与IGPS活性中心结合能力强的化合物；最后通过体外酶活性动力学实验、抑菌(无毒株和有毒株)实验及细胞水平毒理实验进行筛选，获得能抑制结核分枝杆菌繁殖和生长且细胞毒性较小的新型活性化合物ATB26，其有望被开发为新型抗结核药物。

1材料与方法

1.1　IGPS的结构模拟

本研究选用了一个开源的蛋白质结构模拟软件Modeller 8.0(http://www.salilab.org/modeller/modeller.html)[6]。针对结核分枝杆菌标准株H37Rv的IGPS序列，用Modeller软件进行结构建模。通过Mollder objective function参数，选择该值最低的模型。模型评价采用DOPE potential参数。IGPS结构的合理性评价采用网络模型评价系统(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/rapper/rampage.php)绘制Ramachandran图进行。

1.2　IGPS结构的分子动力学模拟

研究蛋白质结构的分子动力学模拟采用GROMOS87力场[7]。模拟过程中，采用周期性边界条件，将模拟的IGPS放入边界距离蛋白表面≥1.5 nm的立方盒中，溶剂水模型为单点电荷(simple point charge，SPC)模型，填充该立方盒，水分子数目为19 622。此外，为保持体系的电中性，根据所计算的静电势，8个Na+替换负电荷高密度区域的水分子，进行10 ns的分子动力学模拟采样，使体系充分达到平衡状态。

所有分子动力学模拟通过开源免费软件GROMACS (Version 3.0)[8]实现。实验采用的超级计算机是具有32 Intel 2.8 GHz Xeon CPU的 Lenovo Shenteng1800计算机，分子结构作图软件为PyMOL和VMD。

1.3　分子对接

根据模拟优化后的IGPS结构，用AutoDock程序[9]进行分子对接，以期找到抑制剂的活性构象。采用包含60 000个化合物结构的Maybridge数据库，由英国Maybridge Chemical Comapny免费提供。

1.4　酶的分离纯化及酶活性测定

IGPS的制备参照文献[10]。酶活性测定反应体系包含470 μl 5 mmol/L Tris、10 μl CdRP、20 μl 5 μg/ml IGPS，在280 nm处检测吸光值。设立只有IGPS无CdRP以及只有CdRP无IGPS的对照体系，对照体系可排除IGPS和CdRP对吸光值的影响[11]。酶活性单位的定义为：37 ℃反应条件下，每分钟催化CdRP形成1 μmol/L IGP的酶活性定义为1 U[12]。

1.5　化合物的体外抑菌实验

结核分枝杆菌无毒株H37Ra、标准有毒株H37Rv、临床耐药及敏感菌株等均由上海市肺科医院乐军博士惠赠。细菌在含10% OADC的7H9培养基中生长。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司，用于溶解小分子化合物，配制成5 mg/ml溶液。有毒株H37Rv、临床耐药及敏感菌株实验均在上海市肺科医院进行。

将结核分枝杆菌配制成1 mg/ml的菌液，取5 μl，含1×105~5×105个细菌，接种到500 μl 7H9液体培养基中，然后加入不同浓度的化合物，置37 ℃恒温孵箱内培养，3周后观察结果。

1.6　化合物的细胞毒性实验

实验细胞株为具有吞噬功能的悬浮细胞THP-1。采用甲基噻唑蓝(methylthiazoly tetrazolium，MTT)比色法。在96孔板中，每孔加入100 μl约5 000个细胞和一定浓度的化合物溶液，共同培养24 h；加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h；加入100 μl甲臜(formazan)溶解液，至蓝紫色晶体全部溶解，于570 nm测吸光值。化合物用DMSO溶解。

1.7　化合物与IGPS体外结合能力的测定

IGPS溶于含1% DMSO的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，调整浓度为720 μg/ml。将IGPS固定在芯片上。化合物浓度梯度为1×10-5mol/L、0.25×10-5mol/L、0.157×10-6mol/L和0.195×10-7mol/L。按仪器使用说明，用BIACORE 3000生物大分子相互作用分析仪测定化合物与蛋白的结合能力[13]，测定平衡解离常数(Kd)。

2结果

2.1　结核分枝杆菌H37Rv来源的IGPS建模

在Modeller搜索到的与结核分枝杆菌IGPS同源性较高的晶体结构(表1)中选择1VC4A(PDB ID)为模板，利用Modeller 8.0软件进行同源建模，获得H37Rv IGPS的5个三维结构，分别为IGPS_1、IGPS_2、IGPS_3、IGPS_4和IGPS_5，其Modeller objective function值分别为1 633.370 5、1 745.012 0、1 681.453 7、1 650.790 6和1 611.094 2。

表1　Modeller搜索到的与结核分枝杆菌IGPS同源性较高的晶体结构Tab.1　Structures with high similarity with IGPS of M.tuberculosis

根据模板1VC4A(图1A)和5个IGPS模型(图1B)的DOPE值曲线，发现5个模型的DOPE值曲线与模板曲线走势基本一致，表明这5个模型与模板均有很好的一致性。

结构模型IGPS_5的objective function值最低，因此选择其作为IGPS的最佳模型，进行深入研究。结果显示，结核分枝杆菌标准株H37Rv来源的IGPS结构(图2)属典型的(β/α)8模型，具有8个β折叠组成的内核结构，外周包含8个α螺旋，之间通过柔性较大的环结构相连。

A: 1VC4A. B: Five IGPS models.图1　模板1VC4A(A)以及5个IGPS模型(B)的DOPE得分曲线Fig. 1　The DOPE score profile of 1VC4A and 5 IGPS models

图2　IGPS中的预测活性位点Fig.2　The predicted active sites in IGPS

2.2　IGPS结构模型的评价

IGPS结构模型的Ramachandran图(图3)表明，249个点(92.2%)位于合理区域；12个点(4.4%)在允许区域；9个点位于不合理区域(3.3%)。表明模拟获得的IGPS结构模型中各Cα两个相邻肽单位的构象比较合理，且具有立体化学允许的二面角(Φ，Ψ)所规定的构象，即构象能量最低，构象稳定、合理。

图3　IGPS结构模型的Ramachandran图Fig.3　Ramachandran plot of IGPS

2.3　同源序列比对预测IGPS的活性中心

为确定IGPS结构中化合物的对接位点，本课题组对其活性位点进行了理论预测。首先，与研究较多的包括大肠埃希菌在内的一些菌株来源的IGPS序列进行多重序列比对，推测出相关重要氨基酸在结核分枝杆菌来源的IGPS中的位置。结果发现，文献报道的相关氨基酸在H37Rv来源的IGPS中位置分别为57E[14]、119K、168E[14]、189N[15]、219E[15]，其中119K被认为是可能的酸供体，219E为碱供体[15]。这些活性相关的氨基酸及保守性较高的氨基酸主要位于由β折叠和β/α环组成的区域(图3)。在对接计算中，选取作用范围的半径为22.5 Å，其范围超过分子中作用腔的半径(最大半径15~18 Å)，因此筛选覆盖了整个可能的活性区域。

2.4　化合物的计算机辅助筛选

选择Number of conformations、Final docked energy、Estimated free energy of binding等参数评价对接结果，筛选并购买综合效果最好的100个化合物进行生物学实验。由图4可见，化合物在IGPS的结合位置主要位于β折叠组成的桶状结构上端(β折叠的C端)和β/α环，该位置是含(β/α)8结构的蛋白的一个共有活性中心[16]。表明结核分枝杆菌来源的IGPS其结构和功能均具有典型的(β/α)8结构特征，属于典型的(β/α)8结构蛋白。

2.5　化合物ATB26的体外抑菌实验

抑菌实验结果表明，化合物ATB26(图5)对结核分枝杆菌H37Ra的最小抑菌浓度为0.2 μg/ml(表2)。本研究还验证了化合物ATB26对临床分离耐药菌株(至少对异烟肼、利福平具有抗性)的抑菌效果，以标准毒株H37Rv为对照。结果表明，化合物ATB26对H37Rv及临床耐药菌株的最低抑菌浓度约为0.1 μg/ml。

A: Bird’s eye view. B: Plat view.图4　IGPS与化合物的结合模式Fig. 4　Binding of ligands with IGPS

图5　化合物ATB26的结构式Fig.5　Structure of ATB26

表2　化合物ATB26抑制结核分枝杆菌生长的部分实验结果Tab. 2　MICs of ATB26 for different M. tuberculosis strains

* Eight MDR strains used.

2.6　化合物ATB26对IGPS活性的影响

检测ATB26在体外对IGPS活性的影响，结果显示，ATB26对IGPS活性有明显抑制作用，表明IGPS抑制剂可能在细胞内通过与IGPS结合并抑制其活性而影响细菌正常生长(图6)。

图6　化合物ATB26对IGPS酶活性的抑制作用Fig.6　Inhibition of ATB126 on IGPS activity

2.7　化合物ATB26与IGPS的体外结合能力

不同浓度ATB26与IGPS的结合曲线显示，ATB26与IGPS的结合能力随ATB26浓度的升高而增强，即ATB26与IGPS的结合能力与其浓度呈正相关。ATB26与IGPS的Kd值为2.3E-6，表明ATB26与IGPS具有较强的体外结合能力，可抑制IGPS的生物学活性(图7)。

Representative sensorgrams obtained from injection of ATB26 at concentrations of 1×10-5 mol/L, 0.25×10-5 mol/L, 0.157×10-6 mol/L and 0.195×10-7 mol/L (from up tp down).图7　化合物ATB26与IGPS的体外结合能力曲线Fig.7　Kinetic analysis of ATB26 binding to IGPS by SPR technology using BIACORE 3000

2.8　化合物ATB26的细胞毒性实验

利用人源细胞THP-1验证ATB26的细胞毒性。因为药物溶于DMSO溶液，首先需选择合适的DMSO浓度以消除DMSO对实验的影响。结果表明，高浓度DMSO对细胞毒性较大，当DMSO浓度为3%时对细胞毒害作用较小，因此选择3%为DMSO使用的最高浓度(图8A)。

A： Effect of DMSO on the growth of THP-1 cells. B： Effect of drugs at different concentrations on the growth of THP-1 cells. The tests were repeated five times. INH, isoniazid; ETH, ethambutol.图8　化合物ATB26的细胞毒性实验Fig.8　Effect of ATB26 on the growth of THP-1 cells

选取目前临床常用的一线药物异烟肼(isoniazid)和乙胺丁醇(ethambutol)，稀释成不同浓度，进行THP-1细胞毒性实验。结果发现，2种药物在高浓度时均具有一定细胞毒性，影响细胞正常生长。在较低浓度时，细胞毒性较弱。在浓度为50 μg/ml时，乙胺丁醇组细胞存活率超过90%，异烟肼组细胞存活率也有80%左右。化合物ATB26细胞毒性较小，与乙胺丁醇和异烟肼相当。ATB26浓度为50 μg/ml时，细胞存活率维持在90%以上，表明其无明显的细胞毒性，可用于进一步的药物开发实验(图8B)。

3讨论

基于人类基因组及后续功能基因组研究的深入，形成了“从基因组到药物” 的药物研究新模式[17]。在细胞和分子水平弄清疾病发生机制后，人们可发现并确证潜在的药物作用靶标，然后针对其靶标有的放矢地寻找药物。该过程包含3个重要步骤：①发现与确证新靶标；②发现和优化新型药物先导化合物；③药物开发[18]。随着分子生物学和结构生物学的发展，一些靶标生物大分子的功能被阐明，三维结构被测定。药物分子设计已广泛应用于创新药物先导结构的发现和优化并取得突破性进展，同时带动了药物分子设计新方法的快速发展[19]，药物分子设计已成为创新药物研究的核心技术之一。

本研究以结核分枝杆菌H37Rv来源的IGPS作为筛选新型抗结核药物的靶点，通过计算机辅助药物设计获得有潜力的抗结核药物。在虚拟筛选中，采用优化后的IGPS结构模型，利用AutoDock程序进行基于结构匹配和能量匹配的分子对接计算，筛选能很好地与IGPS活性中心结合的药物先导化合物，然后分别进行体外酶活性动力学实验、抑菌(无毒株和有毒株)实验及细胞水平的毒理实验，得到包括ATB26和ATB107[20]在内的能有效抑制结核分枝杆菌繁殖和生长且无细胞毒性的新型活性化合物。对这些化合物，将进行体内模型杀菌实验筛选，有望获得抗结核分枝杆菌尤其是抗耐药结核分枝杆菌的新型药物。本研究证明，结核分枝杆菌来源的IGPS是一个有效的筛选新型抗结核药物的靶点。

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为了促进及帮助本刊读者提高专业英语写作水平，上期刊出了2句中文科技词句，这一期将刊出其对应的英文词句，供读者对比学习。

1.In light of the current outbreak of Ebola virus disease, there is an urgent need to develop effective therapeutics to treat Ebola infection, and drug repurposing screening is a potentially rapid approach for identifying such therapeutics.

评议：应用In light of表达“鉴于”值得学习。

drug repurposing screening中的repurposing，中文中未表达，该词是说明“有目的”筛选，可供药物学撰写中参用。

2.Although the active compounds found to block Ebola VLP entry need to be further tested in wild-type Ebola virus infection assays and in animal models to confirm their antiviral activity, our results represent a proof-of-principle investigation supporting the suitability of this assay for rapid screening of Ebola antiviral compounds that inhibit viral entry.

评议：proof-of-principle与proof-of-concept不同。前者用于阐明对实验方法的确证，后者用于阐明对一种理论的证实。

应用suitability(适用性)有特点，中文中未表达。

英文常可以用较长的句子，但是认为超过6行的句子为过长。

·论著·

·论著·

Corresponding author. SHEN Hong-Bo, E-mail: hbshen@ips.ac.cn

Screening of novel inhibitors of indole-3-glycerol phosphate synthase fromMycobacteriumtuberculosis

ZHOU Tao1,2, WANG Fei-Fei3, HUANG Qiang4, WANG Hong-Hai4, SHEN Hong-Bo2

1. School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 3.Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 4. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Abstract:In this study, the structure of indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) from Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) H37Rv was obtained by homologous modeling. Based on the IGPS structure, virtual screening was carried out to select novel inhibitors from the Maybridge database with about sixty thousand organic compounds. Through biological selection, one compound, named ATB26, was identified as a potential inhibitor of IGPS, which showed potent antimycobacterial activity not only against M. tuberculosis H37Rv, but also clinical isolates of multidrug-resistant M. tuberculosis strains with minimum inhibition concentration (MIC) of 0.1 μg/ml. ATB26 could bound tightly to IGPS in vitro and inhibited activity of IGPS. These results suggest that ATB26 is a novel potent inhibitor of IGPS, a potential target for the development of new anti-tuberculosis drugs.

Key words:Indole-3-glycerol phosphate synthase；Mycobacterium tuberculosis； Inhibitor

收稿日期：(2015-02-13)

通信作者：沈洪波

基金项目：中国科学院重点部署项目(KSZD-EW-Z-006)，上海市科委科技支撑项目(13431900103)