鸡传染性支气管炎的诊断技术

李前，苟春天

（1.甘肃省会宁县畜牧兽医局，甘肃会宁 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 750001）

鸡传染性支气管炎的诊断技术

李前1，苟春天2

（1.甘肃省会宁县畜牧兽医局，甘肃会宁 730070；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 750001）

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触传染性的禽呼吸道疾病。该病可以发生于所有日龄的鸡，主要侵害呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统，发病鸡主要变现为咳嗽、喷嚏、气管音，产蛋量和蛋品质下降。雏鸡感染此病易产生呼吸道和肾脏病变而造成死亡，本病目前在世界范围内流行，对养鸡业造成重大经济损失。由于冠状病毒特殊的转录机制，导致新的变异株和血清型不断产生，使该病的防制变得十分困难。近年来，该病的流行呈上升趋势，尤其是肾致病型IB，已成为我国规模化养鸡场的主要传染病之一，因此对该病的诊断显得尤为重要，本文对IB的诊断方法进行简要的综述。

1 临床诊断

本病可感染不同日龄的鸡，感染雏鸡常表现为呼吸道症状，咳嗽、喷嚏、气管音，随病情的发展逐渐表现为全身性症状，出现精神萎靡、羽毛蓬乱、食欲废绝。产蛋鸡出现产蛋量下降，蛋品质下降，如蛋清稀薄、软壳蛋和畸形蛋等。对病鸡进行剖检，常可观察到气管环出血，肾脏肿大，有尿酸盐沉积，呈现“花斑肾”，输卵管、卵泡变形等典型症状。临床上通过流行病学调查结合临床症状和病理剖检可对本病做出初步诊断。

2 病毒分离

病毒的分离鉴定是诊断该病最为经典、直观、可靠的方法。由于IBV感染后最早侵害的部位是气管，因此，气管是分离IBV的首选靶器官，此外也可选择肺、肾脏作为分离IBV的靶器官。无菌采集病料后，充分研磨，反复冻融3次后，离心，取上清液过滤除菌。将滤液通过尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，通过连续传代至鸡胚出现卷曲、矮小典型病变或死亡。同时也可将病毒纯化后制备负染样品置于电镜下进行病毒形态观察，进行确诊。

3 血清学诊断技术

目前血清学诊断是实际检测中的常用技术，主要包括病毒中和试验（VN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、琼脂扩散试验（AGP）、免疫荧光抗体技术（FA）等。

3.1 中和试验（VN）

VN试验具有较高的敏感性和特异性，被广泛用于IBV野毒株的分离鉴定及血清分型。VN试验可以在鸡胚、鸡胚肾细胞（CEKC）或气管环培养物上进行，最常用的是鸡胚法。一般采用固定病毒稀释血清法，将病毒稀释成每单位剂量含200或100EID50，与等量的2倍系列稀释的被检血清混合，置37℃下作用60min，每一稀释度接种3～6枚9～11日龄SPF鸡胚，观察7d，根据鸡胚死亡率计算中和效价。

3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA既可以检测抗体，也可以检测抗原。此方法具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点。常用的ELISA方法有间接ELISA、阻断ELISA、抗原捕获ELISA和单抗夹心ELISA等。目前，国内外已经有商品化的ELISA检测试剂盒出售。该方法尤其适用于大规模的检测，还可以通过检测IgM水平来诊断鸡群是否存在新的感染。

3.3 琼脂扩散试验（AGP）

AGP的抗原阳性率与病毒的致病性、病毒的感染剂量、鸡的日龄及感染时抗体的存在状态有关。琼脂扩散试验具有较高的灵敏性和特异性。同时具备操作简单、资金耗费少等优点。用1%的琼脂糖制成平板，用梅花打孔器打出梅花孔，将中心孔中加满抗原，将外周孔中加满倍比稀释的待检血清，置37℃温箱中，24～48 h即可观察结果。

3.4 免疫荧光抗体技术（IFA）

IFA可用于IBV抗原抗体检测，IFA被广泛的应用于检测IBV在组织中的定位，其检测结果具有直观性。运用IFA检测抗原组织定位时，虽然将组织的冰冻切片作为己知抗原效果较好，但由于冰冻切片的制作程序复杂、耗时较长，该方法并不适用于临床应用及鸡群抗体的监测。

4 分子生物学诊断技术

分子生物学检测技术具有灵敏、快速的优点，被广泛应用于IBV的检测中。该技术主要包括逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Q-PCR)、限制性内酶切片段长度多态性分析(RFLP)和核酸探针技术。

4.1 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR（Q-PCR）

RT-PCR是在基因水平上对IBV进行诊断，RT-PCR通过一对引物介导，在体外快速扩增特定的核酸片段，根据电泳结果即可作出初步诊断，测序后可进一步确诊。实时荧光定量PCR是PCR技术与荧光技术的结合，根据荧光随时间的变化而扩增的曲线来确定是否有相关病原的存在，同时可以对病原进行定量测定，具有极高的灵敏性和特异性。

4.2 限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP）

RFLP技术被广泛应用于遗传学研究，可利用病毒基因酶切图谱对其进行分型。该技术的原理是通过RT-PCR方法扩增到DNA片段，再用限制性内切酶进行消化，不同血清型IBV的PCR产物经消化后产生数目不等，长度不一的DNA片段，与标准毒株对照即可鉴定血清型。

4.3 核酸探针技术

核酸探针技术是用构建好的DNA片段，通过碱基互补配对的原理与病原核酸进行杂交，从而确定病原的同源序列。该方法具有灵敏性高、特异性强、简便、快速等特点。此外，该方法还可对病原进行定位和定量。常用的核酸探针技术有Northern杂交、斑点杂交、Southern杂交、原位杂交等。

综上所述，诊断鸡传染性支气管炎的方法有很多，每种方法都有其优缺点，在应用时，要根据实际需要来选择最合适的方法，有时甚至需要几种方法相结合才能获得满意的结果。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．05.100