猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定

马世杰,李 坤,付朋飞,郭晓庆,高晓云,崔保安,陈红英

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定

马世杰,李 坤,付朋飞,郭晓庆,高晓云,崔保安,陈红英

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

【目的】 构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(LactobacilluscaseiCECT5276)，为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】 从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因，再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游，得到重组质粒pMJ67-IFN-α，电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA，进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RT-PCR检测猪IFN-α mRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平；采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析，检测其表达产物的活性；用双抗体夹心ELISA法确定最适的乳糖诱导质量浓度。【结果】 PCR扩增获得了501 bp的IFN-α，成功构建了重组质粒pMJ67-IFN-α，转化干酪乳酸杆菌后获得了重组乳酸杆菌。半定量RT-PCR结果显示，IFN-α mRNA在诱导16 h时表达水平最高；Western blot分析表明，构建的重组干酪乳酸杆菌成功表达出了相对分子质量约19 ku的重组蛋白，其可与鼠抗猪IFN-α抗体发生特异性反应。ELISA结果表明，当乳糖诱导质量浓度达到8 g/L时，猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大，为1.3 μg/L。【结论】 将猪IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸杆菌基因组中，构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达猪IFN-α成熟蛋白。

猪α-干扰素；干酪乳酸杆菌；电穿孔转化；抗病毒

猪病毒性疾病严重影响着我国畜牧业的发展，并造成了重大的经济损失，研发一种安全高效的抗病毒制剂受到越来越多的关注。猪α-干扰素(IFN-α)作为一种有效的抗病毒细胞因子，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统的一员[1]，其对猪的流行性腹泻、轮状病毒腹泻、传染性胃肠炎等多种病毒性疾病有较强的防制作用[2-7]。汤仁树等[8]对重组猪IFN-α的体外抗病毒活性进行了研究，发现重组猪IFN-α在体外可有效抑制猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等对猪肾(PK-15)细胞的致病变作用。

干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)能够有效调节肠道微生物之间的平衡，增强机体的免疫力和抵抗力，是最早被广泛应用的益生菌之一，其产生的非解离乳酸能够有效地抑制肠道致病菌，尤其是大肠杆菌的生长[9]。近几年来，已有在啮齿类动物和猪上通过用乳酸杆菌作为载体来表达外源基因，并用表达蛋白刺激黏膜产生免疫反应的报道[10-12]。如果能将IFN-α基因导入干酪乳酸杆菌，使其稳定表达并发挥抗病毒和抑菌作用，将具有潜在的临床应用价值。因此，本研究将猪IFN-α基因克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游，电穿孔转化干酪乳酸杆菌，通过红霉素筛选，获得稳定表达猪IFN-α的重组干酪乳酸杆菌，为进一步开发重组乳酸杆菌口服疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 质粒、菌株 pMJ67载体购自Biomedical公司；pMD18-IFN-α质粒由河南省动物源性食品安全重点实验室构建并保存。干酪乳酸杆菌CECT5276由河南省动物源性食品安全重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂与培养基 限制性内切酶EcoRⅠ、KpnⅠ，T4连接酶、DNA聚合酶，均购自郑州奥瑞吉生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京康为科技有限公司；质粒抽提试剂盒购自美国Thermo公司；高纯总RNA快速提取试剂盒(Tril-离心柱型)购自上海捷瑞生物工程有限公司；动物组织基因组DNA小量制备试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购自宝生物工程(大连)有限公司；猪IFN-α单克隆抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗购自中山金桥公司；猪IFN-α ELISA试剂盒购自北京嘉美有限公司(含猪IFN-α蛋白标准品)；MRS培养基购自英国Oxoid公司。

1.2 引物设计与合成

参照GenBank中发表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank登录号AY776246)，利用引物设计软件Primer 5.0设计1对引物，用于扩增猪IFN-α基因(501 bp)。引物由上海生物工程有限公司合成。

IFN-α上游引物：5′-GTCGGTACCTGTGACCTGCCTCAGACC-3′，下划线部分为KpnⅠ酶切位点；IFN-α下游引物：5′-GGCGAATTCTCACTCCTTCTTCCTGAG -3′，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。

1.3 猪IFN-α基因的PCR扩增

以质粒pMD18-IFN-α为模板，PCR扩增IFN-α。反应体系为25 μL：质粒pMD18-IFN-α 1 μL(20 ng/μL)，上、下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，ddH2O 11 μL，TaqDNA酶12 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。用水作为模板设立阴性对照。取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳。参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异性DNA条带。

1.4 重组质粒pMJ67-IFN-α的构建

用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切回收、纯化的PCR产物，克隆到同样处理的整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游，获得重组质粒pMJ67-IFN-α。将pMJ67-IFN-α转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒pMJ67-IFN-α，进行PCR扩增鉴定(并用水作为模板设立阴性对照)及KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切、EcoRⅠ 酶切鉴定，并将其送上海生物工程有限公司测序，用DNAStar软件对测序结果进行序列分析。

1.5 重组质粒的电转化与鉴定

将100 μL 干酪乳酸杆菌感受态细胞与500～700 ng的重组质粒pMJ67-IFN-α(体积不超过10 μL)在冰浴条件下混匀，加入到冰预冷的0.1 cm电转化杯中，冰上放置10 min。使用Bio-Rad公司电转仪进行电转(电压800 V)；电转后迅速加入1 mL含有100 g/L蔗糖的MRS培养基，转入1.5 mL离心管中，37 ℃孵育3 h。取电转化产物100 μL涂抹在含5 μg/mL红霉素的MRS平板上，37 ℃厌氧培养36 h。

挑取菌落在含5 μg/mL红霉素的MRS液体培养基中扩大培养，取1.0 mL菌液12 000 r/min离心1 min，弃上清，用0.5 mL灭菌的去离子水悬浮，利用动物组织基因组DNA小量制备试剂盒提取干酪乳酸杆菌基因组DNA。然后利用猪IFN-α特异性引物按1.3节中扩增条件进行PCR扩增，用水作为模板设立阴性对照，对PCR产物进行测序。

1.6 重组干酪乳酸杆菌中猪IFN-α mRNA的转录

1.6.1 内参基因16S rRNA引物的设计与合成 参照GenBank中发表的干酪乳酸杆菌16S rRNA基因序列(GenBank登录号：NR_075032.1)，利用引物设计软件Primer 5.0设计1对特异检测引物(16S F:5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′；16S R:5′-CACCGCTACACATGGAG-3′)，预期扩增片段长度为341 bp。

1.6.2 半定量RT-PCR检测猪IFN-α mRNA的转录水平 用高纯总RNA快速提取试剂盒提取重组猪IFN-α干酪乳酸杆菌总RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录为cDNA。利用猪IFN-α特异引物，以合成的cDNA为模板，按1.3节中的条件扩增猪IFN-α 基因。PCR扩增干酪乳酸杆菌 16S rRNA基因，反应体系为25 μL：16S rRNA cDNA 1 μL(50 ng/μL)，上、下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，ddH2O 11 μL，TaqDNA酶12 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min后置4 ℃保存。从扩增的猪IFN-α 基因和干酪乳酸杆菌 16S rRNA基因产物中分别取4 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，用Grab-It成像系统成相并分析各条带的灰度值，以猪IFN-α基因对内参基因(16S rRNA)的灰度值记录结果。

1.7 重组干酪乳酸杆菌中IFN-α的诱导表达及活性检测

将4 mL含质粒pMJ67-IFN-α的重组乳酸杆菌接种至100 mL MRS培养基中，加入乳糖至终质量浓度为8 g/L，诱导培养过夜，同时设立含质粒pMJ67的重组乳酸杆菌为对照组。采用Western blot 法对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析。取菌液12 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入10 mL PBS悬浮沉淀进行超声破碎(100×10 s，275 W)。将破碎后的菌体与5×上样缓冲液混合，沸水中煮10 min，于80 V电压下进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳25 min，然后调电压至120 V电泳90 min。将分离胶和相同大小的浸泡过的硝酸纤维膜放入转印槽中，用半干法转膜，15 V转膜50 min。将膜浸入封闭液(TBST+50 g/L脱脂奶粉)，缓慢振荡1 h；TBST洗3次，每次5 min，将膜放入平皿中，加入猪IFN-α单克隆抗体，4 ℃过夜；TBST洗3次，将膜放入平皿中，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗，孵育2 h；TBST洗3次，在DAB显色液中显色。

1.8 乳糖诱导质量浓度的确定

采用双抗体夹心ELISA法确定乳糖的最佳诱导质量浓度。选择质量浓度依次为0，0.125，0.25，0.5，1和2 μg/L的猪IFN-α蛋白标准品做标准曲线，试验重复3次。将含质粒pMJ67-IFN-α的重组乳酸杆菌和未重组的干酪乳酸杆菌分别接种至MRS培养基中，加入乳糖至终质量浓度分别为0，5，8和10 g/L，诱导培养过夜。取菌液12 000 r/min 离心10 min，收集菌体后，加入10 mL PBS悬浮沉淀进行超声破碎(100×10 s，275 W)。取破碎后的菌体加样，每孔加入100 μL，将反应板充分混匀后置37 ℃下作用40 min；用洗涤液充分洗板4～6次；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL；洗板；每孔加入酶标抗体工作液100 μL，置37 ℃下作用10 min；洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应10 min；每孔加入100 μL终止液；用酶标仪读取OD值，波长为450 nm，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 猪IFN-α基因的PCR扩增

利用猪IFN-α特异性引物，对质粒pMD18-IFN-α进行PCR扩增，获得1条约501 bp的片段(图1)，与预期的扩增片段大小相符。

2.2 重组质粒pMJ67-IFN-α的鉴定

2.2.1 PCR扩增及酶切鉴定 对重组质粒pMJ67-IFN-α进行PCR扩增，获得1条约501 bp的目的条带(图2)。重组质粒经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后出现了2条带，其中1条带为载体条带(长度约为4 895 bp)，另1条为插入的目的条带(长度约为501 bp)；经EcoRⅠ酶切，出现1条长度约 5 500 bp的特异性条带(图2)，与预期结果相符。

2.2.2 序列测定及分析 所测序列全长为501 bp，为猪IFN-α成熟蛋白基因(501 bp)，其与GenBank中发表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank登录号：AY776246)的同源性为100%，表明重组质粒pMJ67-IFN-α构建成功。

2.3 猪IFN-α基因重组干酪乳酸杆菌的鉴定

提取经红霉素筛选呈阳性的干酪乳酸杆菌DNA，进行PCR扩增，出现1条约501 bp的片段(图3) ，与预期扩增片段长度相吻合。对PCR扩增产物进行测序，所获序列与GenBank中发表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank 登录号：AY776246) 同源性为100%。结果表明IFN-α基因成功整合到干酪乳酸杆菌中。

图3 猪IFN-α基因重组干酪乳酸杆菌的PCR鉴定结果
M.DNA Marker DL2000；1.PCR产物；2.阴性对照
Fig.3 PCR amplification of IFN-α gene in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276
M.DNA Marker DL2000;1.PCR products;2.Negative control

图4 重组干酪乳酸杆菌中猪IFN-α mRNA转录水平的半定量RT-PCR检测结果
M.DNA Marker DL2000；1～4.乳糖诱导12，14，16，18 h时猪IFN-α mRNA的RT-PCR产物；6～9.乳糖诱导12，14，16，18 h 时16S rRNA的RT-PCR产物；5，10.阴性对照
Fig.4 RT-PCR analysis of pig IFN-α mRNA in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276
M.DNA Marker DL2000;1-4.RT-PCR products of pig IFN-α mRNA at time 12,14,16,and 18 h,respectively; 6-9.RT-PCR products of 16S rRNA at time 12,14,16, and 18 h,respectively;5,10.Negative control

2.4 RT-PCR检测猪IFN-α mRNA含量

重组干酪乳酸杆菌经乳糖诱导后猪IFN-α mRNA表达的琼脂糖凝胶电泳结果见图4。用Grab-It成像系统对各条带的灰度值进行分析，结果显示，经7.5 g/L乳糖诱导12，14，16，18 h样品的相对灰度值分别为0.54，0.63，1.74和1.71，表明猪IFN-α mRNA在诱导16 h时转录水平最高。

2.5 猪IFN-α蛋白活性的Western blot检测

Western blot结果(图5)显示，含有重组质粒pMJ67-IFN-α的重组菌体出现1条约为19 ku的蛋白，而只含表达质粒pMJ67的重组菌体在19 ku处没有条带。结果表明，重组干酪乳酸杆菌表达的目的蛋白是猪IFN-α成熟蛋白。

图5 重组干酪乳酸杆菌诱导表达猪IFN-α 的Western blot检测结果
M．蛋白Marker；1.pMJ67转化菌菌体；2.重组菌菌体
Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein inLactobacilluscaseiCECT5276 with lactose induction
M.Protein Marker;1.LactobacilluscaseiCECT5276 transformed with pMJ67;2.RecombinantLactobacilluscaseiCECT5276

2.6 乳糖最佳诱导质量浓度的确定

以IFN-α标准品的质量浓度为自变量(x)，以OD450为固变量(y)绘制标准曲线，求回归方程，结果见图6。

图6 IFN-α的标准曲线
Fig.6 Standard curve of IFN-α

对不同质量浓度乳糖诱导的样品进行检测后，发现当乳糖质量浓度达到8 g/L时，猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大，为1.3 μg/L,且重组乳酸杆菌组与干酪乳酸杆菌组差异显著(P<0.05)(图7)，故乳糖最佳诱导质量浓度为8 g/L。

3 讨 论

随着重组蛋白技术的发展完善，猪IFN-α基因的表达系统也有了更多的选择。大肠杆菌表达系统具有结构简单、遗传背景清楚的特点，但其表达产物易形成包涵体，翻译后加工修饰体系不完善，同时高表达时易错误折叠使表达产物无活性，导致作用受限。毕赤酵母表达系统具有表达量高、可诱导、糖基化机制接近高等真核生物的特点，但表达的蛋白产物易降解，表达量不可控。干酪乳酸杆菌作为表达和传递外源基因的载体系统，具有安全性高及通过先天性免疫激活肠道黏膜免疫系统的特点[13]，尤其是一些经过筛选的干酪乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，免去了目的蛋白的体外提纯等后加工过程。本试验利用的乳酸杆菌表达系统为干酪乳酸杆菌菌株和整合型表达载体pMJ67，使猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中得到了稳定的表达。

由于革兰氏阳性菌有较厚的细胞壁，所以常规的转化方法不适合将外源基因转化到乳酸杆菌中。应用电穿孔法可在干酪乳酸杆菌、植物乳酸杆菌中获得较高的转化效率(每μg DNA可得106～7转化子)，弥补了在其他菌种中电穿孔法转化效率不高(每μg DNA可得102～3转化子)[14]的缺陷。有学者研究了不同情况下pLHR质粒对乳酸杆菌的转化效率，认为影响转化效率的因素有电压、培养液中甘氨酸的浓度、细菌含量等[15]。本试验采用的方法仅需准备高压灭菌过的三蒸水、10%甘油、含1.2%甘氨酸的MRS培养液，操作方法与大肠杆菌电转化基本相同，并成功地将猪IFN-α基因整合到干酪乳酸杆菌的基因组中。

本试验对重组干酪乳酸杆菌中猪IFN-α的表达情况在mRNA水平和蛋白水平上进行了分析，RT-PCR检测发现猪IFN-α mRNA在诱导16 h时含量最高；Western blot分析表明，在乳糖诱导的重组干酪乳酸杆菌体内表达出了约19 ku的目的蛋白，与猪IFN-α成熟蛋白理论分子质量大小相符；ELISA检测表明，猪IFN-α成熟蛋白在乳糖诱导质量浓度为8 g/L时表达量最高，且表达产物具有较好的反应活性，这为下一步将该菌株用于抗病毒和抑菌作用的研究奠定了基础。

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Expression and reactivity of porcine interferon-alpha inLactobacilluscasei

MA Shi-jie,LI Kun,FU Peng-fei,GUO Xiao-qing,GAO Xiao-yun,CUI Bao-an,CHEN Hong-ying

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou，Henan450002,China)

【Objective】 This study aimed to construct the recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 that could stably express porcine IFN-α to increase the immunity of animals as an oral vaccine.【Method】 Porcine IFN-α gene was amplified from plasmid pMD18-IFN-α,and then directionally cloned into the down-stream of lactose-inducible promoter of integrative vector pMJ67.The integrative plasmid pMJ67-IFN-α was transformed intoLactobacilluscaseiCECT5276 by electroporation.Genomic DNA was extracted and identified by PCR product sequencing.The transcriptional level of porcine IFN-α mRNA was detected in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 by RT-PCR.The expression product of the recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 and concentration of lactose induction were detected by Western blot and ELISA.【Result】 The recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 (501 bp) was identified by PCR product sequencing.The highest expression level of porcine IFN-α mRNA was detected 16 hours after induction in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276,as revealed by RT-PCR for amplification of porcine IFN-α gene.The 19 ku expressed protein of porcine IFN-α and the specificity were identified by Western blot.The optimal concentration of lactose induction of 8 g/L was tested by ELISA and the highest expression level was 1.3 μg/L.【Conclusion】 The recombinantLactobacilluscaseiwas obtained successfully.

porcine interferon-alpha;Lactobacilluscasei;electroporation;antiviral

2014-01-10

河南省重大科技专项(111100110300)

马世杰(1987-)，男，河南新郑人，硕士，主要从事分子免疫学和分子病毒学研究。 E-mail:participate2006@126.com

陈红英(1965-)，女，四川仁寿人，教授，博士后，硕士生导师，主要从事分子免疫学和分子病毒学研究。 E-mail:chhy927@163.com

时间:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.028

S852.65+1

A

1671-9387(2015)07-0029-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.028.html