微小残留白血病检测在AML治疗及预后判断中的意义

文 钦,陈 果,钟江帆

(1.第三军医大学新桥医院全军血液病中心,重庆 400037；2.美国南加州大学keck医学院 90089-0641)

·综 述·

微小残留白血病检测在AML治疗及预后判断中的意义

文 钦1,陈 果1,钟江帆2

(1.第三军医大学新桥医院全军血液病中心,重庆 400037；2.美国南加州大学keck医学院 90089-0641)

微小残留白血病;急性髓细胞白血病;治疗;预后

急性髓细胞白血病(AML)是较为常见的造血系统恶性克隆性疾病，尤其是成人急性白血病。据国外文献报道，大剂量化疗后完全缓解率约为50%～80%，但由于缓解后复发，仅30%～40%的年轻患者，不及20%的老年患者能达到长期无病生存[1-3]。究其根源，微小残留白血病(MRD)是导致白血病复发的重要原因，对于微小残留病变，目前尚无统一标准定义，但现有的技术可以在一定程度上对MRD进行相关指标的检测，现有的研究也表明，利用多参数流式细胞技术(multiparameter flow cytometry，MFC)以及实时荧光定量PCR(RQ-PCR)等手段监测MRD对于明确诊断后治疗决策的选择以及治疗后预后判断均有重要意义[4-5]。以下就MRD相关指标的检测在AML治疗及预后中的研究及应用进展进行阐述。内容涉及MRD检测方法简述、MRD检测与AML危险度分层及治疗决策及MRD检测与疾病预后。

1 MRD检测方法

MRD定义为急性白血病完全缓解后体内残留微量白血病细胞的状态。即患者症状、骨髓及外周血形态学以及病理学检测提示完全缓解，但体内仍存在白血病细胞的情形。因此MRD检测主要利用细胞遗传学、分子遗传学及免疫学技术，曾有文献报道过细胞培养的方法，即在体外培养条件下靠特定的培养条件来实现对白血病细胞的筛选及鉴别，但这种方法阳性率低，很难控制条件，且对能够生长的细胞仍需进行相关鉴定。同样，早期的核型分析及免疫学方法由于敏感性较低近年相关研究较少也不在此处赘述[6]。目前用于检测MRD的主要方法为MFC以及RQ-PCR。

1.1 MFC 该方法适用于大多数的AML患者，因为其测定的是完整的细胞，并能结合细胞分选进一步进行细胞亚型分析。对于目标基因为罕见的突变基因者，流式细胞术更具可行性。相对于RQ-PCR，还有一个重要优势在于成本低[7]。Lacombe等[8]报道，相对于传统的流式细胞技术，多参数的设置将显著提高MRD检测的可靠性及灵敏度，适当的参数设置可使其灵敏度提高到约103～104。

1.2 RQ-PCR 近年来兴起的RQ-PCR技术是一种将荧光基团加入PCR反应体系，利用荧光信号的累积实现对整个PCR反应进程的实时监测，并对起始模板进行定量分析的方法。有别于普通PCR在反应结束后对终产物的定量分析，RQ-PCR技术在扩增的指数期对起始模板进行定量。该技术的飞速发展为MRD分子遗传学检测带来了新的突破，利用这项技术，可以针对已知的异常融合基因、突变基因及过表达基因进行检测，其灵敏度可达103～105[9-10]。

2 MRD检测在白血病分层及治疗决策选择中的意义与现状

细胞遗传学的异常可以说是评估白血病患者危险程度及判断其预后的最可靠的指标。每当收治AML患者时，首要的任务就是对其危险程度进行判断和分层，然后据此制订接下来的诊疗计划。例如，一位患者本应属于低危组，那么如果将其按照高危组进行大剂量化疗或者异基因造血干细胞移植，显然对病情并不十分有利，反之亦然。国外调查显示，成年AML患者中约有50%能检出有意义的克隆性染色体改变，根据细胞遗传学检测可将AML患者危险程度分为高、中、低危3组，处于高危组的患者长期生存率仅5%～10%[11]。细胞遗传学方法评估白血病危险度有利于高危组和低危组的鉴别，但是对于中危组，尤其是一些有罕见异常基因的患者，这项检查的可靠性仍不尽如人意，随着近年来越来越多新的分子标记被发现并鉴定，细胞遗传学检测技术能检测的范围也将得到极大的扩展，有助于更可靠地评估AML危险度。

细胞遗传学检测技术的发展使白血病的治疗效果有了进一步提高，但是必须看到，利用细胞遗传学技术进行危险度分层依然困难重重。(1)前文提及的一些罕见的基因突变。事物是发展变化的，各种新的基因改变层出不穷，现有的技术如何来适应这种变化，如何在这种情况下达到较高的检测可靠性，以适应临床诊疗活动的需要，无论对研究者还是临床工作者都是一项艰巨的任务。(2)在日益强调治疗个体化的今天，每位患者因其具体情况的不同，所接受的治疗方案也不同，文献报道，使用不同治疗方案最终的复发率有很大的差异。

对于AML，约40%患者可检出NPM1突变而不伴有FLT3-ITD基因突变，这类患者的危险程度相对于FLT3-ITD基因联合突变的患者来说较低，前者有较好的治疗反应，经标准化治疗后平均无病生存期也较后者更长。综合以上，将细胞遗传学检测结果与患者的治疗方案及治疗结果相结合来评估AML患者的危险程度，采取相应的治疗手段更为合适。对于儿童AML进行类似分析也得出一些相同结论，例如：应当将标危组MRD阳性的患者归为高危组[12]，从而采用相应的治疗方案。由此可见MRD检测对于AML的危险度分级以及与之对应的治疗决策的选择具有重要意义。

3 MRD监测在患者预后评估中的意义与应用

临床上不少化疗达完全缓解的患者在随访过程中出现异常基因，短期内疾病复发。当然，相当一部分失访患者往往是在其复发时才返院，大部分患者能检测出细胞遗传学的异常。然而遗传学无异常的患者也不代表绝对不复发,研究报道，即使是检测出较为有利的核型，仍然有少部分患者最终会复发[13]。尽管如此，在大多数情况下，白血病细胞学检测往往落后于基因检测，因此对于化疗缓解或移植后患者，MRD监测有助于提示早期复发，从而采取相应措施予以干预，以期提高治疗成功率，减少复发，延长患者无病生存期。对于移植后患者，MRD监测同样有重要意义。以RQ-PCR为手段的MRD监测可以在异基因造血干细胞移植之后量化检测供、受体细胞比例，同时在一定程度上达到预测复发的目的。对于某些已知的基因突变，如前文提及的NPM1，利用目前已有的技术已能进行残留病的检测，进而早期发现疾病复发的迹象，但对于一些新发现的或者未知的遗传学异常，目前的MRD监测仍然做不到。

既往有研究提示嵌合体的检测可用于移植后MRD监测。Bader等[14]对81例儿童AML患者进行监测，结果发现其中19例患者嵌合体基因与白血病复发呈正相关，只有供者基因或仅少量嵌合体基因的患者3年无病生存率高于嵌合体基因比列高的患者，提示嵌合体基因与白血病复发有关。但是，Huisman等[15]的研究得出的结论与之并不一致，仅在25%的患者中找到嵌合体与复发的联系，尽管在移植后6个月间两者具有某种联系，但不能作为预测白血病复发的指标。

另外，对于MRD监测，研究者选用NPM1和FLT3突变基因、WT1基因等作为监测的目标基因，发现相对于联合FLT3-ITD基因突变的患者来说，NPM1突变的患者预后更好[16]。WT1基因则更趋向于一种亚群检测，对预报白血病复发意义不大[17]。

Kern等[18]使用MFC技术检测AML细胞特异性的LAIPs信号，该信号与AML的发生密切相关，研究发现，检出LAIPs阳性细胞的患者在移植后3～6周的复发率高达60%。而LAIPs阴性患者则表现出持续缓解。由此推知，利用MFC对免疫表型的分析有助于移植后监测MRD，对患者预后有提示作用，但要将这项技术用于常规的临床实验室检查仍有许多问题需要进一步的研究解决。

4 展 望

随着医学技术的发展，对于AML患者，其无病生存率以及生活质量均得到了显著提高。即使是高危患者，也可以采取大剂量化疗，或者造血干细胞移植等手段缓解病情，甚至有望达到长期无病生存。但是，白血病一旦复发，其再次治疗的难度和危险性大大增加，因此，如何减少缓解后复发，如何早期诊断白血病复发并采取适当措施进行医疗干预，在白血病治疗中是极其重要的一环。利用MFC和RQ-PCR等手段监测MRD对于明确诊断后治疗决策的选择以及治疗后预后判断均有重要意义。然而必须看到，现有的实验室检测还远未达到在临床普及的程度，相关的研究仍然需要进一步的深入，对于MRD的认识仍有待进一步加深。相信在未来大量研究的支持下，会有一个统一的标准来评估白血病残留的情况，这将极大促进MRD监测在临床应用的实施，从而实现白血病复发的早期诊断和早期干预。

[1]Lo WG.Strategies in the treatment of acute myeloid leukemia[J].Haematologica,2004,89(9):1029-1032.

[2]Suciu S,Mandelli F,De Witte T,et al.Allogeneic compared with autologous stem cell transplantation in the treatment of patients younger than 46 years with acute myeloid leukemia (AML) in first complete remission (CR1):an intention-to-treat analysis of the EORTC/GIMEMAAML-10 trial[J].Blood,2003,102(4):1232-1240.

[3]Burnett AK,Goldstone AH,Stevens RM,et al.Randomised comparison of addition of autologous bone marrow transplantation to intensive chemotherapy for acute myeloid leukemia in first remission:results of MRC AML10 trial[J].Lancet,1998,351(9104):700-708.

[4]Buccisano F,Maurillo L,Del Principe MI,et al.Prognostic and therapeutic implications of minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia[J].Blood,2012,119(2):332-341.

[5]Courtney D， Nardo D，Selina M.Beyond morphology:minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia.[J].Curr Opin Hematol,2012,19:82-88.

[6]陈琳军，丁训杰．微量残留白血病检测方法研究进展[J]．肿瘤，1998，18(2)：58-60．

[7]Grimwade D,Vyas P,Freeman S.Assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia[J].Curr Opin Oncol,2010,22(6):656-663.

[8]Lacombe F,Arnoulet C,Maynadié M,et al.Early clearance of peripheral blasts measured by flow cytometry during the first week of AML induction therapy as a new Independent prognostic factor:a GOELAMS study[J].Leukemia,2009,23(2):350-357.

[9]Shook D,Coustan-Smith E,Ribeiro RC,et al.Minimal residual disease quantitation in acute myeloid leukemia[J].Clin Lymphoma Myeloma,2009,9 Suppl 3:S281-285.

[10]Santamaría C,Chillón MC,Fernández C,et al.Using quantification of the PML-RARalpha transcript to stratify the risk of relapse in patients with acute promyelocytic leukemia[J].Haematologica,2007,92(3):315-322.

[11]Grimwade D,Hills RK,Moorman AV,et al.Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia:determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials[J].Blood,2010,116(3):354-365.

[12]Alonzo TA,Go PA,Gerbing RB,et al.Conventional cytogenetics molecular profiling,and flow cytometric response data allow the creation of a two-tiered risk-group system for risk-based therapy allocation in childhood AML-a report from the children's oncology group[J].Blood,2010,116(21):334-335.

[13]Campana D.Determination of minimal residual disease in leukemia patients[J].Br J Haematol,2003,121(6):823-838.

[14]Bader P,Kreyenberg H,Hoelle W,et al.Increasing mixed chimerism defines a high-risk group of childhood acute myelogenous leukemia patients after allogeneic stem cell transplantation where pre-emptive immunotherapy may be effective[J].Bone Marrow Transplant,2004,33(8):815-821.

[15]Huisman C,De Weger RA,De Vries L,et al.Chimerism analysis within 6 months of allogeneic stem cell transplantation predicts relapse in acute myeloid leukemia[J].Bone Marrow Transplant,2007,39(5):285-291.

[16]Schnittger S,Kern W,Tschulik C,et al.Minimal residual disease levels assessed by NPM1 mutation-specific RQ-PCR provide important prognostic information in AML[J].Blood,2009,114(11):2220-2231.

[17]Barragan E,Pajuelo JC,Ballester S,et al.Minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia by mutant nucleophosmin (NPM1):comparison with WT1 gene expression[J].Clin Chim Acta,2008,395(1/2):120-123.

[18]Kern W,Danhauser-Riedl S,Ratei R,et al.Detection of minimal residual disease in unselected patients with acute myeloid leukemia using multiparameter flow cytometry for definition of leukemia-associated immunophenotypes and determination of their frequencies in normal bone marrow[J].Haematologica,2003,88(6):646-653.

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.008

文钦(1980-)，硕士，主治医生，主要从事血液病方面的研究。

R733.7

A

1671-8348(2015)29-4054-03

2015-04-08

2015-07-21)